Trabajos Fin de Master Ofertados por el IBMCP 2018-2019

Español

Investigador: Alejandro Atarés

Proyecto: Fusión de protoplastos en especies hortícolas.

En nuestro grupo de investigación se han llevado a cabo distintos trabajos para evaluar la tolerancia al estrés hídrico de una serie de accesiones de especies silvestres de la familia Cucurbitaceae. Se han seleccionado dos del género Cucumis (C. africanus L4 y C. dipsaceus) como las más resistentes a la sequía (Baragé, 2002). Hasta la fecha no se ha podido abordar la transferencia de genes deseables desde especies silvestres de la familia Cucurbitaceae al acervo génico del melón debido a las estrictas barreras de incompatibilidad sexual. Sin embargo, en trabajos previos de nuestro grupo hemos desarrollado un protocolo de fusión de protoplastos que nos permite la hibridación somática de melón y la posterior selección del material híbrido (Atarés, 2004). En este trabajo pretendemos abordar la hibridación somática mediante fusión de protoplastos de melón con diversas especies del género Cucumis sp. con alta tolerancia al estrés hídrico. La principal ventaja de esta técnica es que permite salvar las barreras de incompatibilidad sexual que existen entre distintas especies, en nuestro caso, melón y las especies silvestres seleccionadas. Información de contacto: aatares@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Marcos De la Peña

Proyecto: Caracterización funcional de RNAs circulares con ribozimas codificados en genomas de plantas.

En nuestro laboratorio hemos descrito recientemente una curiosa familia de retroelementos con ribozimas (los Retrozimas, Cervera et al. Genome Biol 2016) distribuidos ampliamente en multitud de genomas de plantas. Dichos retrotransposones se acumulan abundantemente en el transcriptoma de la célula vegetal como pequeños (600-1000 nt) RNAs no codificantes circulares, característica que los hace únicos y que sugiere que podrían desempeñar diversos papeles biológicos en las plantas que los contienen. El objetivo de este Trabajo Fin de Máster será llevar a cabo una caracterización molecular de dichos RNAs circulares, tanto en sus huéspedes naturales como en sistemas modelo (N. benthamiana y A. thaliana) mediante transformación genética con diversas construcciones de retrozimas. El trabajo permitirá aprender y utilizar las técnicas y herramientas multidisciplinares empleadas en nuestro laboratorio, y en las que fundamentalmente se combina Bioinformática, Bioquímica y Biología Molecular y Estructural de ácidos nucleicos en plantas. Información de contacto: rivero@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Vicente Moreno

Proyecto: Mutagénesis insercional en tomate.

En este trabajo utilizaremos la mutagénesis insercional como herramienta para la identificación de genes clave implicados en el desarrollo del fruto de tomate, así como alguno de los genes que determinan la tolerancia al estrés salino e hídrico, tanto en tomate (moderadamente tolerante a la sal) como en diversas especies silvestres relacionadas (accesiones muy tolerantes al estrés hídrico y salino). Con esta estrategia, los genes quedan etiquetados por el T-DNA, lo que facilita considerablemente el proceso de clonación. En nuestro grupo disponemos de una amplia colección de líneas de inserción y de mutantes previamente identificados con los que poder abordar el trabajo planteado. Información de contacto: vmoreno@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Carmen Hernández

Proyecto: Estudio de mecanismos de traducción no-canónicos en RNAs virales.

Los virus utilizan la maquinaria traduccional del hospedador para producir sus proteínas. Por esta razón, muchos RNAs virales presentan las mismas características estructurales que los mRNAs celulares que son generalmente monocistrónicos y contienen un residuo 7-metilguanosina (m7GpppN), o cap, en el extremo 5’ y una cola poliA en el extremo 3’. Aunque ambos tipos de estructuras son determinantes para el reclutamiento de los ribosomas, más del 80 % de RNAs de virus de plantas carecen de ellas, y han desarrollado estrategias alternativas para su traducción. Aunque hay pocos datos al respecto, se cree que el empleo de estas estrategias les puede conferir cierta ventaja a los virus, por ejemplo, facilitando su expresión génica en condiciones en las que la traducción convencional esté afectada. El objetivo del trabajo será el análisis de elementos en el RNA viral involucrados en mecanismos de traducción no canónicos y la posible identificación de factores celulares reclutados por los mismos. Asimismo, se explorará el potencial de estos elementos como herramientas biotécnológicas. Entre las técnicas a emplear se contempla la purificación de DNA/RNA, electroforesis de ácidos nucleicos, clonación de DNA, PCR, mutagénesis dirigida, análisis Northern, transformación de bacterias, transcripción in vitro, ensayos de traducción en plantas y/o protoplastos, análisis Western e inoculación de virus en plantas de forma mecánica o por agroinfiltración, entre otras. Información de contacto: cahernan@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Benito Pineda

Proyecto: Etiquetado de genes en especies silvestres relacionadas con el tomate.

Los diferentes estreses, tanto bióticos como abióticos, a los que se ven sometidas las plantas cultivadas son una de las principales causas de las bajadas en su rendimiento y calidad. Diversas especies silvestres relacionadas con el tomate presentan una mayor tolerancia a estos tipos de estrés que las variedades de tomate cultivadas. En este trabajo utilizaremos una herramienta genómica, el etiquetado de genes, en varias especies silvestres relacionadas con tomate para identificar secuencias codificantes o elementos de regulación de genes de interés para la mejora. Información de contacto: bpineda@btc.upv.es

 

Investigadores: Miguel A. Pérez-Amador y María Dolores Gómez

Proyecto: Estudio de la función de las giberelinas en la iniciación y desarrollo de los óvulos en Arabidopsis

Las giberelinas (GAs) son hormonas vegetales que regulan multitud de procesos fisiológicos tales como germinación, elongación del tallo, fotomorfogénesis, crecimiento de la hoja y de la raíz, floración, desarrollo del polen y fructificación. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que las GAs también están implicadas en la iniciación de los óvulos determinando tanto el número como la forma de éstos. En las últimas décadas, se han identificado numerosos genes implicados en la determinación de la identidad de los óvulos y en su desarrollo. Sin embargo, se conoce muy poco sobre qué genes determinan el número de óvulos. Desde un punto de vista económico y agronómico, es importante determinar cuáles son estos factores ya que el número de óvulos determina en gran medida el número de semillas y por tanto afecta al rendimiento de los cultivos. Nuestro objetivo es comprender cómo las GAs regulan la iniciación y desarrollo de los óvulos de Arabidopsis y de otras especies de interés agronómico, y cómo la vía de señalización de GAs interactúa con las vías de señalización de auxinas, citoquininas y brasinoesteroides que también participan en este proceso de desarrollo. El trabajo de máster podrá realizarse en diversas líneas de trabajo: a) caracterización de genes dianas de GAs identificados mediante RNAseq en óvulos de Arabidopsis; b) la caracterización morfológica de los óvulos y semillas en plantas con mutaciones en genes de la ruta de señalización de GAs y c) estudio molecular de la interacción de la ruta de señalización de GAs con otras rutas hormonales. La realización del proyecto conllevará el aprendizaje de técnicas de biología molecular y microscopía. Información de contacto: mpereza@ibmcp.upv.es, mdgomez@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Pedro Luis Rodríguez Egea

Proyecto: Regulación de la señalización del ABA y tolerancia a sequía mediante E3 ubiquitín ligasas que regulan el recambio de fosfatasas 2C

La sequía es una limitación muy importante para la productividad de los cultivos. La agricultura representa el 70% del consumo total de agua y se prevé que las necesidades mundiales de agua superen el suministro sostenible de agua en un 40% para el año 2030. El impacto del calentamiento global sobre los patrones climáticos y las precipitaciones podría reducir el rendimiento de los cultivos al menos un 25% y por lo tanto se requiere el desarrollo de estrategias para mejorar el rendimiento de los cultivos bajo déficit hídrico. En este escenario, el ácido abscisico (ABA) es una fitohormona que juega un papel clave ya que controla la eficiencia en el uso del agua por la planta a través de la regulación de la apertura estomática y mediante ajustes a largo plazo que resultan en el mantenimiento de la asimilación neta de carbono. La ruta de transducción del ABA es crítica en la fisiología de la respuesta al estrés por sequía y para desarrollar una mayor eficiencia en el uso del agua. Por ello, la regulación del recambio y la vida media de los componentes centrales de señalización del ABA tendrá un gran impacto en la respuesta de la planta a la sequía. La ubiquitinación es una modificación postraduccional de proteínas que controla numerosos procesos fisiológicos. En las plantas, tanto las respuestas de estrés biótico como abiótico, así como la respuesta hormonal, son reguladas por la maquinaria de ubiquitinación, la cual controla la vida media de los componentes críticos para la señalización. Diversos tipos de ubiquitinación conducen a diversos destinos de las proteínas diana, tales como la degradación por el proteasoma 26S o bien a través del sistema ESCRT y degradación vacuolar. Recientemente hemos desempeñado un papel pionero (Wu et al., 2016. Plant Cell) en los estudios que han identificado componentes de la maquinaria de ubiquitinación claves para regular la vida media de fosfatasas tipo 2C (PP2Cs), las cuales son los principales reguladores negativos de la ruta del ABA. Como resultado de ello hemos identificado E3 ligasas, RGLG1 y Cullin3-RING ubiquitín ligasas, que tienen como diana a las PP2Cs. En el proyecto vamos a caracterizar y explorar el uso biotecnológico de las mismas para regular la degradación de las PP2Cs y reforzar la tolerancia a sequía Más información y publicaciones del grupo en: http://www.ibmcp.csic.es/es/personas/pedrorodriguezcsices; https://www.researchgate.net/profile/Pedro_Rodriguez11/citations?sorting... Información de contacto: prodriguez@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Alejandro Ferrando

Proyecto: Funciones de la espermidina y biosíntesis de proteínas en la tolerancia del polen a las altas temperaturas

Teniendo en cuenta la seria amenaza que supone el calentamiento global para la disponibilidad de alimentos basados en la agricultura, nos parece de especial relevancia abordar el estudio sobre cómo las altas temperaturas afectan negativamente al proceso de germinación del polen y crecimiento del tubo polínico y elucidar posibles efectos sobre los mecanismos globales de transcripción y traducción. En el proyecto actualmente en desarrollo en nuestro laboratorio nos hemos centrado en estudios globales del transcriptoma y del traductoma mediante tecnologías punteras basadas en secuenciación masiva de librerías de polen germinado a temperatura permisiva y temperatura restrictiva mediante la técnica de perfil de huella ribosomal. Empleando la planta modelo Arabidopsis thaliana, muy adecuada para posteriores análisis bioinformáticos, esperamos identificar posibles alteraciones a nivel de regulación global de la traducción en el crecimiento del polen en esas condiciones. Completamos esos estudios mediante técnicas proteómicas para validar los datos obtenidos. Esperamos que los datos obtenidos en Arabidopsis permitan el diseño de estrategias biotecnológicas de mejora aplicables a cultivos de interés agronómico. Buscamos estudiantes con alto grado de motivación e ilusionados por aprender tecnologías moleculares avanzadas en el marco de un proyecto de investigación en curso con orientación biotecnológica. Información de contacto: aferrando@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Jose Gadea y Regina Niñoles

Proyecto: Identificación de factores de transcripción que regulen enzimas de defensa antioxidante de la semilla como vía para aumentar su longevidad.

Uno de los mecanismos moleculares que condiciona el envejecimiento de la semilla es la oxidación de los componentes celulares del embrión, probablemente por la entrada de oxígeno del aire a través de la cubierta de la semilla. Este inevitable deterioro puede ser reparado por mecanismos celulares (catalasas, superoxidodismutasas, etc) cuando la semilla se rehidrata y comienza su germinación. Sin embargo, las redes moleculares que regulan estos procesos de reparación no son muy conocidas. En este proyecto, pretendemos identificar factores de transcripción que estén regulando las defensas antioxidantes que la semilla dispara durante la germinación para reparar el daño oxidativo generado durante su almacenamiento. Para ello, realizaremos inicialmente estudios de coexpresión de los diferentes genes antioxidantes expresados en la semilla, y buscaremos motivos conservados en sus promotores mediante programas informáticos. El siguiente paso será realizar estudios de interacción DNA-proteína para identificar factores de transcripción que se unan a esos motivos. Pare ello, utilizaremos la estrategia de yeast-onehybrid: los fragmentos de promotores seleccionados serán clonados dirigiendo la expresión de un gen marcador (lacZ) y transformados en levadura. Estas cepas se cotransformarán con una librería de expresión de factores de transcripción (TFs) de la planta Arabidopsis y se realizará el screening que identificará los TFs candidatos a regular esos genes. El objetivo futuro es modular la expresión de los mismos para generar plantas que resistan mejor el envejecimiento de la semilla. Información de contacto: jgadeav@ibmcp.upv.es; renioro@upvnet.upv.es

 

Investigadores: Concha Gómez Mena y José Pío Beltrán.

Proyecto: Estudio de los mecanismos moleculares de la producción de frutos sin semillas en tomate.

El desarrollo del ovario en un fruto (cuajado del fruto) depende de que ocurra la polinización y fertilización del mismo y puede verse comprometido por condiciones ambientales desfavorables. Sin embargo, en algunas especies el cuajado del fruto puede desacoplarse de la fertilización generando así frutos sin semillas (partenocárpicos). La partenocarpia es un carácter apreciado en la industria y a la vez, una herramienta valiosa para dilucidar las bases genéticas y moleculares que controlan el proceso de cuajado del fruto. En el laboratorio hemos aislado un mutante estéril de tomate (hydra) cuya mutación está asociada a la producción de frutos sin semillas (partenocárpicos). El gen HYDRA ha sido clonado (Rojas-Gracia et al 2017) y codifica una proteína represora que controla el inicio de la esporogénesis y por tanto la formación de los gametos. Mediante el análisis de genotipos partenocárpico hemos podido demostrar una correlación entre la esterilidad masculina y el desarrollo del ovario en ausencia de fertilización. El proyecto en el que se enmarcaría el TFM pretende estudiar el potencial de la esterilidad masculina en la obtención de partenocarpia en tomate. Para ello se generarán líneas estériles de tomate mediante edición genética utilizando la tecnología CRISPR/Cas9. La participación en este proyecto implica la utilización de técnicas de Biología Molecular, microscopía y transformación genética de plantas. Información de contacto: cgomezm@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Vicente Pallas

Proyecto: Descrifrando interacciones virus-planta esenciales para la susceptibilidad y/o resistencia en el virus del cribado del melon

Los virus de plantas siguen siendo una de las principales amenazas para los cultivos agrícolas. Las pérdidas económicas ocasionadas por estos patógenos se han estimado en 50.000 millones de euros por año en todo el mundo. Esta situación podría incluso empeorar dadas las nuevas condiciones medioambientales ocasionadas por el actual cambio climático. Debido a la naturaleza biotrófica de los virus de plantas, estos patógenos necesitan tejido vivo para su multiplicación y por lo tanto su proceso de infección debe implicar numerosas interacciones entre los componentes del virus (ARN y proteínas) y el huésped (ARN, proteínas, lípidos, membranas). Estas interacciones pueden facilitar o por el contrario limitar/contrarrestar la infección del virus. Los fenotipos patológicos son el resultado de la interferencia y/o competición por una cantidad sustancial de los recursos del huésped lo que puede derivar en una disfunción de la fisiología del mismo y causar la enfermedad. Durante los últimos años nuestro Grupo ha iniciado una línea de investigación consistente en tratar de descifrar las interacciones que ocurren entre proteínas virales y factores del huésped que son esenciales para la susceptibilidad o la resistencia del huésped. Para abordar estos estudios estamos trabajando con dos patosistemas diferentes: el virus del cribado del melón (MNSV)/plantas de melón y el virus del mosaico de la alfalfa (AMV)/arabidopsis. MNSV y AMV afectan muy significativamente a las cucurbitáceas por una parte (MNSV) y a las solanáceas y leguminosas por otra (AMV). El patosistema MNSV/melón ha emergido en los últimos años como un modelo de referencia para el estudio del movimiento intracelular de los virus por un lado y para los estudios de la resistencia genética, por otro. Por otra parte, el AMV y los ilarvirus son objetos indispensables para el estudio de la multifuncionalidad de las proteínas de cubierta (CP). Como continuación de los proyectos anteriores en esta propuesta queremos descifrar las principlaes interacciones de las proteínas de movimiento del MNSV y las CPs del MNSV y del AMV, respectivamente, con factores del huésped que condicionan la infección de estos dos virus en sus huéspedes respectivos. Tanto las MPs como las CPs no solo se requieren para los procesos de transporte o encapsidación del genoma viral, respectivamente, sino que constituyen efectores universales del proceso patogénico a través de interacciones directas o indirectas con factores y/o rutas endógenas. Recientemente hemos obtenido una sólida evidencia de que el MNSV usurpa la ruta de translocación intracelular hacia los cloroplastos/mitocondrias y por otra parte hemos observado los primeros indicios para un virus de plantas (AMV) de que pueden utilizar la ruta de modificación postranscripcional del RNA tipo N6-metiladenosina (m6A) como un nuevo mecanismo regulador en su ciclo biológico. El objetivo general del presente Proyecto es descifrar el mecanismo de reconocimiento que las proteínas virales utilizan para usurpar la ruta de señalización dual hacia cloroplastos y mitocondrias. Estos estudios pueden ayudar al desarrollo de nuevas estrategias antivirales y a predecir la durabilidad de las resistencias. Información de contacto: vpallas@ibmcp.upv.es Nota: El Proyecto tiene asociada una Beca FPI que se iniciaría durante 2018. Es muy probable que el inicie este TFM consiguiera dicha beca FPI.

 

Investigadores: Eduardo Bueso y Ramón Serrano

Proyecto: Identificación de factores de transcripción que regulan la longevidad de semillas vía AtHB25 y COG1 mediante rastreo por “one hybrid”.

En nuestro grupo de investigación se han identificado dos factores de transcripción que alargan la vida útil de las semillas, una de las características más apreciadas tanto por las empresas de agricultura como por las Instituciones implicadas en la conservación de la Biodiversidad. Estos factores de transcripción son COG1 y AtHB25 que principalmente regulan el crecimiento de la cubierta de la semilla. Sin embargo estos genes tienen a su vez reguladores más importantes agua arriba. Para identificarlos proponemos un rastreo con una librería de cDNA que cubre el 75% de todos los factores de transcripción de Arabidopsis. Para el rastreo utilizaremos la técnica de “one hybrid” y un gen reportero nos facilitará la detección de los candidatos. Lo único que nos falta es una persona como tú que le entusiasme la Biología Molecular. Además se promete el mejor ambiente del IBMCP. L@s alunm@s interesados pueden dirigirse al laboratorio 1.10 para conocer mejor todos los detalles. Información de contacto: edbuero@ibmcp.upv.es; gaetano.bissoli@mail.com

 

Investigadores: José Antonio Daròs y Alberto Carbonell

Proyecto: Obtención de plantas resistentes al begomovirus de la hoja rizada del tomate de Nueva Delhi mediante la expresión de pequeños RNAs artificiales

El virus de la hoja rizada del tomate de Nueva Delhi (ToLCNDV, género Begomovirus, familia Geminiviridae) es un virus bipartito de DNA monocatenario, transmitido por mosca blanca, que fue descrito inicialmente en la India en 1995 afectando a cultivos de tomate. Más recientemente, en Septiembre de 2012, una raza de este virus se detectó en un cultivo de calabacín en Murcia. Desde entonces se ha extendido por toda la cuenca del Mediterráneo, convirtiéndose en la principal amenaza de origen viral en los cultivos de cucurbitáceas (melón, sandía, pepino y varias especies de calabazas) en esta importante región agrícola. Nuestro grupo ha desarrollado recientemente una estrategia basada en la expresión de pequeños RNAs artificiales para la obtención de plantas resistentes a patógenos de tipo viral y subviral que ha sido corroborada en el caso de un virus de RNA de polaridad negativa, el virus del bronceado del tomate (género Tospovirus, familia Bunyaviridae), y en el del viroide del tubérculo fusiforme de la patata (género Pospiviroid, familia Pospiviroidae). El objetivo de este trabajo de fin de máster (TFM) es aplicar esta estrategia a un virus de DNA de particular relevancia agronómica, como es el ToLCNDV. Los pequeños RNAs artificiales mimetizan la actividad de los microRNAs (miRNAs) y los pequeños RNAs interferentes transactivos (tasiRNAs) endógenos de las plantas. Se expresan a partir de precursores naturales, convenientemente manipulados, de ambos tipos de pequeños RNAs y aprovechan la maquinaria molecular endógena de la planta (nucleasas Dicer y Argonauta, helicasas, metilasas,…) para reconocer, por complementariedad de bases, e inactivar los transcritos de RNA contra los que han sido diseñados. En este TFM, primero se realizará un análisis computacional de los transcritos de RNA del ToLCNDV para determinar las mejores dianas potenciales de los pequeños RNAs artificiales. A continuación, se realizarán las construcciones genéticas que permitirán expresar estos pequeños RNAs en plantas. Seguidamente, se determinará la actividad antiviral de cada uno de los pequeños RNAs en ensayos in vivo de expresión transitoria en plantas de Nicotiana benthamiana inoculadas con el ToLCNDV. Finalmente, se diseñarán nuevas construcciones genéticas para coexpresar combinaciones de los pequeños RNAs antivirales más activos, y su capacidad de protección se ensayará mediante expresión transitoria en cucurbitáceas inoculadas con el ToLCNDV. En última instancia, las construcciones seleccionadas se utilizarán para la transformación estable de variedades de cucurbitáceas de interés agronómico y dotarlas de resistencia frente a este virus tan dañino. Información de contacto: jadaros@ibmcp.upv.es, acarbonell@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Jesús Ángel Sánchez-Navarro

Proyecto: Desarrollo de vectores virales para el silenciamiento de genes de interés en planta.

El silenciamiento génico o conjunto de mecanismos que impiden que un gen específico se transcriba, representa una herramienta muy útil que puede ser aplicada en diferentes áreas de biotecnología de plantas, biología celular, etc. El silenciamiento de genes actúa a dos niveles: silenciamiento génico transcripcional (Transcriptional Gene Silencing o TGS) y silenciamiento génico post-transcripcional (Post-Transcriptional Gene Silencing o PTGS). Los mecanismos de TGS incluyen modificaciones epigenéticas de regiones promotoras o alteraciones de la cromatina, que permiten el bloqueo de la transcripción de un determinado gen. En el caso del silenciamiento PTGS, los mecanismos actúan directamente sobre el RNA mensajero, induciendo su degradación o el bloqueo de su traducción, utilizando para ello moléculas de RNA de pequeño tamaño (de 20 a 25 residuos de nucleótidos) denominadas RNA de interferencia o RNAi. Gracias a estos mecanismos las células modulan la expresión génica de su propio ADN y además intentan evitar la expresión de genes que no son propios (genes de parásitos intracelulares como virus, bacterias y otros eucariotas). Existen diferentes formas de inducir el silenciamiento de un determinado gen incluyendo la sobreexpresión del gen diana, la expresión de regiones del gen como RNA de doble cadena o la utilización de secuencias reguladoras basadas en microRNAs (miRNA), dirigidas al gen de interés, entre otras. Sin embargo, estos métodos dependen de la transformación y regeneración mediada por Agrobacterium, en donde la eficacia de la transformación y las tasas de éxito de la regeneración son factores limitantes, observándose especias vegetales que no se han podido transformar o donde el proceso global puede requerir hasta varios años. Una alternativa al silenciamiento génico mediado por transformación por Agrobacterium, lo representa el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS). Los virus de plantas presentan intermediarios de replicación de doble cadena de RNA, que inducen muy eficientemente el silenciamiento génico durante la infección. La disponibilidad de clones infecciosos de virus de plantas, que permiten la introducción de secuencias de exógenas, ha posibilitado el silenciamiento de genes del huésped, en plazos de tiempo muy reducidos (días). Sin embargo, la utilización de VIGS ha estado condicionada por la disponibilidad de clones infecciosos de virus que afecten especies de interés o que se acumulen en determinados tejidos. En el laboratorio disponemos de clones infecciosos para el virus del mosaico de la alfalfa (AMV; género Alfamovirus), el virus del mosaico del melocotonero (PcMV; género Trichovirus) y el virus latente del clavel (CLV; género Carlavirus). Recientemente, hemos averiguado cómo modificar una de las proteínas del virus (proteína de movimiento, MP) sin afectar a su funcionalidad, permitiendo introducir secuencias de interés de hasta 200 residuos de nucleótidos. En el presente proyecto TFM abordaremos el desarrollo de los clones infecciosos de AMV, PcMV y/o CLV para su utilización como VIGS. Información de contacto: jesanche@ibmcp.upv.es

 

Investigadores: Isabel López Díaz y Esther Carrera

Proyecto: Regulación del metabolismo hormonal en plantas de tomate: Interacción de las giberelinas con otras hormonas.

Las giberelinas (GAs) son hormonas vegetales que controlan diversos procesos del desarrollo de las plantas. Otras hormonas como las auxinas (IAA), los brasinosteroides (BRs) y las citoquininas (CKs) también pueden participar en la regulación en algunos de estos procesos interaccionando con las GAs. Estudios realizados en nuestro laboratorio indican que el incremento de los niveles de GAs o de su respuesta, en plantas de tomate, inhibe la ramificación y reduce el número de óvulos en el ovario mientras que los BRs y las CKs, por el contrario, actúan de forma positiva. También se ha visto que la inducción de la fructificación por IAA en tomate está mediada por cambios en el metabolismo de GAs, demostrándose la interacción entre estas dos hormonas. El objetivo de este proyecto es estudiar la interacción entre las hormonas, GAs, BRs, IAA y CKs, en la regulación de un mismo proceso de desarrollo utilizando tomate como especie modelo. Para analizar la interacción entre las hormonas, estudiaremos el fenotipo de plantas mutantes de GAs en presencia y ausencia de una mutación de deficiencia en BRs o en CKs. Además se compararán los niveles hormonales, cuantificados por Cromatografía Líquida y Espectrometría de Masas (LC-MS), entre las distintas plantas mutantes para determinar de qué forma unas hormonas pueden influir sobre las otras. El efecto de las GAs, los BRs y las CKs sobre la síntesis o localización de las auxinas se estudiará cuantificando el IAA en los distintos tejidos de las plantas mutantes (para GAs, CKs o BRs) y mediante la localización in situ del IAA por medio de tinciones GUS en líneas mutantes donde se ha introducido una construcción indicadora DR5-GUS que responde al IAA. Información de contacto: ilopez@ibmcp.upv.es ecarrera@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Francisco Vera

Proyecto: Nuevos reguladores del crecimiento lateral en plantas.

El sistema vascular de las plantas consiste en una compleja red de tejidos que permiten el transporte de agua y moléculas hacia los órganos donde son requeridas. Por ello, el desarrollo vascular es importante para un correcto crecimiento de las plantas. Uno de los factores que intervienen en este proceso, a nivel de señalización celular, son las hormonas vegetales. En concreto las estrigolactonas son una familia de fitohormonas que hasta ahora eran conocidas por sus efectos sobre la rizosfera y sobre la ramificación, pero que recientemente se han implicado también en el desarrollo vascular. Hasta ahora, se sabe que las estrigolactonas están implicadas en la regulación de la proliferación celular en el cambium vascular, pero se ignora si además regulan la adquisición de patrones específicos en la vasculatura. En este trabajo, se pretende caracterizar de un modo preciso cuales son los efectos a nivel de vasculatura que produce la ausencia de D14, receptor de estrigolactonas, en Arabidopsis thaliana. Información de contacto: fravesi@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Javier Agustí

Proyecto: Biotecnología en Yuca

Se estima que en 2050 la población mundial será de 10.000 millones de personas. Es previsible que este aumento de la población afecte especialmente a los países en desarrollo, comprometiendo seriamente su disponibilidad de alimentos. La yuca (Manihot esculenta) es la planta más cultivada en el África sub-Sahariana, donde alimenta a, aproximadamente, 800 millones de personas (FAO, 2015). La facilidad de su cultivo y su resistencia a altas temperaturas y a la sequía convierten a la yuca en el cultivo ideal (y, en la mayoría de casos, el único posible) para pequeños agricultores. La parte comestible de la yuca es su raíz de reserva, especializada en la acumulación de almidón. El estudiante que se incorpore a este proyecto colaborará en el desarrollo de nuevas herramientas biotecnológicas para la mejora de la yuca. Para ello, el estudiante participará activamente en la caracterización molecular de nuevos genes que, potencialmente, regulan el desarrollo de la raíz de reserva de la yuca, con vistas a generar nuevas líneas (transgénicas) utilizando dichos reguladores. Este trabajo está enmarcado en un proyecto cuyo objetivo final es la mejora de la producción del cultivo. Información de contacto: jagusti@ibmcp.upv.es

 

Investigadores: David Alabadí y Noel Blanco Touriñán

Proyecto: Contribución del complejo prefoldina al desarrollo y a la respuesta al ambiente de Arabidopsis.

El complejo prefoldina (PFD) es un complejo heterohexamérico (PFD1-6), conservado en eucariotas, que se identificó originalmente en animales por su papel en el correcto plegamiento de tubulinas en el citosol. En nuestro laboratorio hemos mostrado que el complejo se relocaliza en el núcleo tras interaccionar con las proteínas DELLA, que son reguladores transcripcionales con un papel relevante en el control de la expresión génica, principalmente en respuesta a cambios ambientales, y que son desestabilizadas por las hormonas giberelinas (GAs). Nuestra hipótesis de trabajo es que parte del papel de las proteínas DELLA está mediado por el complejo PFD. Uno de los abordajes que iniciamos hace tiempo para desafiar la hipótesis es el genético. En la actualidad hemos obtenido el séxtuple mutante y los seis quíntuples, todos ellos con alteraciones en crecimiento y desarrollo. Es de destacar que no se ha descrito ningún mutante pfd en eucariotas más allá de los sencillos. El propósito de este Trabajo Final de Máster es el estudio fenotípico comparativo de los mutantes pfd-sencillos, quíntuples y séxtuple-, para tratar de asignar funciones a las distintas subunidades del complejo. Nos centraremos en fenotipos morfológicos y de desarrollo fácilmente cuantificables -tamaño y arquitectura de la raíz, tamaño de la roseta, morfología de hojas, tiempo de floración o respuesta a GAs-, y en la respuesta a varios estreses -oxidativo y salino- que incluirá el análisis de la expresión de genes marcadores de cada uno de ellos. El proyecto se completará con un análisis transcriptómico por RNA-seq del séxtuple mutante y con el uso de otras técnicas como inmunolocalizaciones y análisis Western de tubulinas en algunos mutantes y la generación de un nuevo alelo pfd6 por tecnología CRISPR/Cas9. Más información en http://plasticity.ibmcp.csic.es/ Información de contacto: dalabadi@ibmcp.upv.es; noelblanco@ibmcp.upv.es

 

Investigadoras: Paz Merelo, Cristina Ferrándiz

Proyecto: Caracterización de los eventos celulares y moleculares que regulan la Parada Global de la Proliferación en Arabidopsis thaliana mediante técnicas de live imaging

Muchas especies de plantas anuales y algunas perennes, entre ellas gran parte de los cultivos con importancia económica, pertenecen al grupo de las plantas monocárpicas. Éstas presentan una única fase reproductiva tras la cual entran en estado de senescencia y mueren. En plantas monocárpicas, después de la producción de cierto número de frutos, se detiene de manera coordinada la actividad de los meristemos reproductivos y, con ello, la producción de flores y frutos. Este proceso se denomina Parada Global de la Proliferación o Global Proliferative Arrest (GPA) y constituye una adaptación evolutiva para asegurar la redistribución de nutrientes hacia la producción de semillas. Desde un punto de vista agronómico, el proceso del GPA constituye una diana importante en programas de mejora de cultivos ya que determina la duración de la fase reproductiva y, por tanto, la producción de frutos y semillas. Este Trabajo Fin de Máster consistirá en determinar la secuencia de eventos celulares y moleculares del GPA en meristemos inflorescentes (MIs) de Arabidopsis thaliana con alta resolución espacio-temporal. Para ello, se emplearán métodos de live imaging basados en microscopía confocal. Se generarán y analizarán plantas transgénicas que contengan genes de interés unidos a proteínas fluorescentes. Concretamente, se seleccionarán genes relacionados con división celular, GPA, regulación de la actividad meristemática, senescencia y señalización, y se monitorizará su patrón de expresión en MIs antes, durante y después del GPA. Este estudio permitirá identificar (i) marcadores morfológicos y moleculares que ayuden a definir cómo y cuándo se produce el GPA con precisión y (ii) genes y señales que regulan las transiciones entre la fase proliferativa, el GPA y la fase de senescencia. Información de contacto: pazmerelo@gmail.com, cferrandiz@ibmcp.upv.es.

 

Investigadores: Vicente Balanzà, Cristina Ferrándiz.

Proyecto: Identificación de factores en el control del final de la floración.

El rendimiento de la mayoría de los cultivos utilizados por el hombre depende en gran medida de la actividad de los meristemos inflorescentes que las plantas desarrollan tras la inducción floral, y en consecuencia, del tiempo que dura esta actividad. Mientras que los factores que controlan el inicio de la etapa reproductiva están altamente estudiados, apenas conocemos lo que ocurre durante el final de la etapa reproductiva. Recientemente hemos identificado la primera ruta génica que participa en el control de esta etapa de desarrollo: La ruta FRUITFULL-APETALA2 (FUL-AP2). Uno de los objetivos principales de nuestro laboratorio es la identificación de señales que regulen la ruta génica identificada así como nuevos módulos reguladores implicados. Interesantemente, los factores identificados implicados en el control del final de la etapa reproductiva son a su vez importantes factores en el control del inicio de la floración, sugiriendo que las mismas señales que controlan el inicio de la floración podrían estar actuando al final del proceso. Por este motivo resulta muy interesante averiguar como afectan diferentes factores ambientales como el fotoperiodo, la temperatura o la calidad de la luz en la parada de los meristemos inflorescentes, y si estas señales se integran a nivel de la ruta FUL-AP2. Con esta finalidad se analizara el impacto de las diferentes señales ambientales caracterizando el desarrollo de la inflorescencia de plantas control y diferentes mutantes implicados en la transición floral y la percepción de dichas señales, registrando el numero de flores/frutos producido. Además se analizará la expresión de diferentes genes implicados en el control de la actividad del meristemo apical del tallo durante estos experimentos mediante Q-RT-PCR o mediante el análisis de diferentes líneas marcadoras fluorescentes. En paralelo se generaran nuevas líneas marcadoras de genes identificados previamente en el laboratorio para analizar su comportamiento durante el desarrollo inflorescente. Por otro lado, el análisis de diferentes mutantes implicados en la regulación de los genes FUL y AP2 podrían proporciona información clave para entender mejor la naturaleza del final de la floración. En esta línea disponemos en el laboratorio de mutantes CRISPR para todos los miR172, 5 en total, que actúan regulando a la familia génica AP2-like. Su caracterización fenotípica respecto al final de la floración, tanto de forma individual como combinada, proporcionara relevante información respecto a su función en este proceso. Para monitorizar su impacto en el funcionamiento del meristemo inflorescente se han generado diversos sensores fluorescentes de su actividad que pretendemos introducir en los diferentes fondos mutantes que disponemos, para su posterior análisis. Información de contacto: vbalanza@ibmcp.upv.es, cferrandiz@ibmcp.upv.es.

 

Investigadores: Francisco Madueño y Reyes Benlloch

Proyecto: Dónde y cómo actúa TERMINAL FLOWER 1 para regular la arquitectura de la inflorescencia.

Las plantas, como organismos sésiles, necesitan adaptarse a los constantes cambios ambientales a las que se ven sometidas durante su ciclo de vida. Así, han desarrollado redes genéticas reguladoras de los procesos del desarrollo que aseguran una correcta adaptación de la morfología de la planta a las condiciones de crecimiento. Esto es especialmente importante en el caso de la regulación de la transición floral y la reproducción. En el laboratorio estudiamos el funcionamiento de la red genética que controla el desarrollo del meristemo apical del tallo durante la transición floral en Arabidopsis. El correcto funcionamiento de esta red genética reguladora se basa en gran medida en la expresión espacio-temporal precisa de determinados factores clave, entre ellos LEAFY (LEAFY), APETALA 1 (AP1) y TERMINAL FLOWER 1 (TFL1). TFL1 especifica la identidad de meristemo inflorescente y se ha sugerido que ejerce la función de “antiflorígeno” por su efecto contrario a la señal móvil que induce la floración en respuesta al fotoperiodo (FT o florígeno). Trabajos previos en el laboratorio han elucidado cómo se regula el patrón de expresión de TFL1 e identificado algunos genes a los que TFL1 regula directamente, entre los que se encuentran algunos factores de transcripción implicados en el funcionamiento del reloj circadiano. Partiendo de estos trabajos, el proyecto que proponemos tiene como objetivo entender en qué tejido de la planta es necesaria la función de TFL1. Una vez identificado el tejido clave para su función, utilizaremos las mismas herramientas para investigar cómo TFL1 modula el funcionamiento del reloj circadiano. Este trabajo proporcionará datos clave para entender el funcionamiento de la red genética que controla el desarrollo del meristemo apical del tallo, y por lo tanto de la arquitectura de la inflorescencia y de la planta. Información de contacto: madueno@ibmcp.upv.es; reyes.benlloch@ibmcp.upv.es

 

Investigadores: Diego Orzáez y Marta Vázquez.

Proyecto: Edición génica mediada por recombinación homóloga en N. benthamiana vía CRISPR-Cas12a

La tecnología CRISPR ha revolucionado el campo de la edición genómica de plantas en los últimos años. Las mellas en el ADN introducidas por las endonucleasas del sistema CRISPR pueden ser reparadas por dos vías diferentes: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). La reparación mediada por HR permite la introducción de ADN en una localización concreta del genoma. Esto permite, a diferencia del NHEJ editar el genoma no solo en la posición deseada, sino también con los cambios deseados. Sin embargo, los mecanismos de HR son muy ineficiente en plantas. Recientemente se han planteado una serie de estrategias destinadas a conseguir mejoras en la eficiencia de reparación homóloga. Una de ellas es la sobreexpresión de enzimas implicadas en el proceso de HR. Otra, la amplificación del número de moléculas de la secuencia donadora mediante el uso de vectores virales como geminivirus. El aumento de la cantidad de enzimas mediadoras de HR junto con la presencia de un gran número de moléculas del ADN donador en el punto de la rotura del genoma se espera que mejoren la eficiencia de HR permitiendo la obtención de plantas editadas. Para probarlo se elegirán dos genes como dianas de la HR, la acetolactato sintasa (ALS) y un factor de transcripción tipo MYB involucrado en la síntesis de antocianos. Mutaciones en la ALS confieren resistencia a herbicidas, mientras la sobreexpresión del MYB lleva a la acumulación de antocianos. El trabajo está enmarcado en un proyecto cuyo objetivo final es la mejora de N. benthamiana y N. tabacum para su uso en la producción de proteínas y compuestos de interés industrial. Proponemos un proyecto que combina trabajo de: - biología molecular, generación de varias construcciones génicas que incluirán la endonucleasa, los ARN guías y la secuencia donadora utilizando la tecnología de ensamblaje de ADN Golden Gate. - biotecnología vegetal, generación de líneas transgénicas de N. benthamiana con las construcciones génicas obtenidas. - genéticos y enzimáticos, genotipar y caracterizar funcionalmente las líneas generadas. Información de contacto: dorzaez@ibmcp.upv.es; marvazvi@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Diego Orzáez y Sara Selma.

Proyecto: Diseño de represores transcripcionales sintéticos basados en CRISPR-Cas9 en N. benthamiana

Las nuevas tecnologías basadas en las nucleasas específicas de secuencia CRISPR-Cas han revolucionado los campos de la biología sintética y la ingeniería metabólica al permitir el desarrollo de herramientas eficientes y precisas. El sistema CRISPR-Cas9 se basa en la acción de una nucleasa tipo Cas a la que se asocia un pequeño guía de ARN que portará la secuencia complementaria a la diana de ADN a la que queremos dirigir la proteína. La especificidad que ofrece este sistema ha hecho que su uso esté ampliamente extendido, con gran número de aplicaciones. En el campo de la biotecnología vegetal se ha utilizado de forma eficaz para la edición de genes, generación de “Knock outs” o para la creación de reguladores transcripcionales sintéticos. El uso del sistema CRISPR-Cas9 como regulador transcripcional sintético se ha conseguido gracias al uso de una proteína Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9). Mediante el uso de ARN guías es posible el dirigir a la proteína dCas9 a la región promotora de un gen seleccionado y regular su expresión. Trabajos previos en nuestro grupo han conseguido obtener una activación transcripcional eficiente en un gen o grupo seleccionado de genes en N. benthamiana mediante variaciones y estrategias de fusión de distintos activadores transcripcionales a dCas9 o su guía de ARN. Sin embargo, la represión transcripcional supone un reto y es necesaria para la futura obtención de circuitos de regulación transcripcional eficientes. Al estudiante que se incorpore en nuestro grupo se le propone la puesta a punto de la represión transcripcional en N.benthamiana mediante el uso del sistema CRISPR-Cas9. Para ello se abordarán distintas estrategias de fusión de dominios de represión a dCas9, así como la incorporación de modificaciones tanto en la estructura de la proteína como de su guía de ARN para favorecer el reclutamiento de más represores de la transcripción. Información de contacto: dorzaez@ibmcp.upv.es , saselgar@doctor.upv.es

 

Investigador: Antonio Serrano Mislata

Proyecto: Coordinación entre crecimiento y defensa en plantas: ¿cómo podemos desacoplarlos?

Para contrarrestar su incapacidad de movimiento, las plantas han desarrollado una estrategia muy eficiente: monitorizar de manera continua las condiciones ambientales y utilizar esta información para optimizar el uso de su maquinaria celular. Un ejemplo claro es que las plantas sometidas a algún tipo de estrés (sequía, alta concentración de sal, temperaturas extremas...) frenan su crecimiento y simultáneamente activan el programa de defensa. Esta respuesta doble está coordinada por las proteínas DELLA que, mediante la interacción con factores de transcripción, inhiben el ciclo celular y activan respuestas que protegen frente al estrés. Con este proyecto querríamos contestar varias preguntas: (1) ¿cómo regulan las DELLA el ciclo celular? (2) ¿se pueden desacoplar las dos respuestas coordinadas por las DELLA? (3) El freno del crecimiento ¿supone por sí mismo una respuesta protectora frente a estrés? Para ello nos centraremos en el desarrollo de la inflorescencia, la región de la planta donde se producen los frutos y que, por tanto, tiene un elevado interés biotecnológico. En el trabajo reciente del laboratorio con la planta modelo Arabidopsis thaliana, hemos encontrado que una mutación en el gen SMR1 (un regulador negativo del ciclo celular) suprime muchos de los defectos en el crecimiento de los mutantes semi-enanos gai-1D (ganancia de función de DELLA). Sin embargo, la respuesta defensiva de las plantas gai-1D smr1-1 apenas parece verse afectada. Estas observaciones sugieren que es posible desacoplar las diferentes funciones DELLA. El proyecto que proponemos profundizará en este análisis a través de 2 objetivos principales: (1) comparar la elongación y la división celular en gai-1D frente a gai-1D smr1-1; (2) comparar el transcriptoma de gai-1D y gai-1D smr1-1. Para la realización de este trabajo se emplearán técnicas de vanguardia en microscopía confocal y biología molecular (RNA-seq, ChIP, etc). Más información sobre nuestro grupo en http://plasticity.ibmcp.csic.es/. Información de contacto: antserra@ibmcp.upv.es

 

Investigador: Maite Sanmartín

Proyecto: Regulación de la diferenciación celular en plantas

Las plantas tienen la capacidad de adaptar sus programas de desarrollo para hacer frente a cambios ambientales, que en ocasiones son adversos, con el fin de asegurarse su supervivencia. Para modificar estos programas de desarrollo, es necesaria una regulación precisa de la expresión génica que está coordinada, en gran parte, por alteraciones en la organización y modificación de la cromatina y la actividad de factores de transcripción. Ambos procesos desempeñan, por tanto, un papel fundamental en el control espacio-temporal de los patrones de expresión de un conjunto de genes permiten que se active la diferenciación celular, como paso previo a la adaptación del desarrollo de la planta. El trabajo que hemos llevado a cabo en el laboratorio nos ha permitido identificar a dos proteínas, MINIYO (IYO) y RIMA, que son componentes básicos de un interruptor molecular que inicia la diferenciación celular en Arabidopsis (Sanmartin et al., 2011; Muñoz et al., 2017). Nuestro modelo postula que IYO y RIMA forman un circuito binario que se activa cuando IYO se traslada desde el citosol al núcleo para activar la fase de elongación transcripcional de un conjunto de genes que desencadenan la diferenciación celular. Sin embargo, los elementos reguladores que controlan el funcionamiento de este interruptor siguen sin resolverse. Establecer los factores reguladores que delimitan la expresión de los componentes de este interruptor es una de las claves para desentrañar el mecanismo que permite la entrada en diferenciación así como para abordar su posterior activación “a la carta.” El proyecto que se propone tiene como objetivo la caracterización de varios motivos conservados en el promotor de IYO de distintas especies de brásicas y la determinación de su papel en la regulación de la expresión de IYO. Para ello, se plantea realizar ensayos de transactivación, cuantificando la actividad luciferasa, para demostrar si el FT asociado a estos motivos es capaz de activar al promotor de IYO. Estos estudios se complementarán con la generación y caracterización de versiones truncadas del promotor y/o mutagenizadas en las cajas predichas de unión al FT para confirmar su unión. En paralelo, se identificarán mutantes de pérdida de función del FT y se cruzarán con líneas marcadoras pIYO::GUS o pIYO::IYO-GFP disponibles en el laboratorio y se determinarán los cambios en su expresión. Finalmente, se caracterizarán líneas inducibles del FT para usarlas posteriormente en experimentos de inmunoprecipitación de cromatina para demostrar la unión del FT al promotor de IYO. Con este proyecto se pretende que el estudiante que lo realicé adquiera una sólida formación en biología molecular y celular, gracias a las distintas aproximaciones propuestas, y desarrolle un pensamiento científico crítico que le será de gran ayuda en su futuro profesional. Información de contacto: msanmart@cnb.csic.es

 

Investigador: Carmen Hernández

Proyecto: Análisis de supresores virales del silenciamiento por RNA

Los virus son parásitos intracelulares obligados que, dada su limitada capacidad codificante, necesitan utilizar numerosos recursos del hospedador para completar su ciclo infeccioso. El hospedador por su parte activa una serie de respuestas defensivas para frenar o limitar el avance de la infección viral. En plantas, una de las respuestas antivirales más eficientes está basada en el proceso de silenciamiento por RNA que es disparado por RNAs de doble cadena virales y que, en última instancia, conduce a la degradación del RNA del virus invasor. Los virus han desarrollado estrategias para contrarrestar este proceso entre las que destaca la producción de proteínas que actúan como supresores de la ruta de silenciamiento (VSRs), al interferir con distintas etapas de la misma. Estos VSRs están siendo objeto de intensa investigación, no sólo por su papel clave en el ciclo biológico de los virus, sino también porque están sirviendo como herramientas para desentrañar rutas de silenciamiento endógenas de la plantas (implicadas tanto en lucha antiviral como en regulación génica), porque constituyen dianas atractivas para el control de virosis y porque, además, presentan gran potencial biotecnológico. El objetivo del trabajo será seguir avanzando en el estudio del modo de acción de VSRs utilizando técnicas de Biología molecular y celular muy diversas, entre las que se incluyen PCR, clonación de DNA, purificación de DNA/RNA, electroforesis de ácidos nucleicos, análisis Northern y/o Western, microscopia confocal, manejo de virus, transformación de bacterias, agroinfiltración de plantas, etc. Información de contacto: cahernan@ibmcp.upv.es

 

Fecha: 
Jueves, 28 Febrero, 2019