Trabajos Fin de Master Ofertados por el IBMCP 2019-2020

Trabajos Fin de Master Ofertados por el IBMCP 2019 Los investigadores del Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas ofrecen los siguientes proyectos para Trabajos Fin de Master Contactad directamente con los investigadores que dirigen los proyectos que más os interesen Investigador: Alejandro Atarés Proyecto: Fusión de protoplastos en especies hortícolas. En nuestro grupo de investigación se han llevado a cabo distintos trabajos para evaluar la tolerancia al estrés hídrico de una serie de accesiones de especies silvestres de la familia Cucurbitaceae. Se han seleccionado dos del género Cucumis (C. africanus L4 y C. dipsaceus) como las más resistentes a la sequía (Baragé, 2002). Hasta la fecha no se ha podido abordar la transferencia de genes deseables desde especies silvestres de la familia Cucurbitaceae al acervo génico del melón debido a las estrictas barreras de incompatibilidad sexual. Sin embargo, en trabajos previos de nuestro grupo hemos desarrollado un protocolo de fusión de protoplastos que nos permite la hibridación somática de melón y la posterior selección del material híbrido (Atarés, 2004). En este trabajo pretendemos abordar la hibridación somática mediante fusión de protoplastos de melón con diversas especies del género Cucumis sp. con alta tolerancia al estrés hídrico. La principal ventaja de esta técnica es que permite salvar las barreras de incompatibilidad sexual que existen entre distintas especies, en nuestro caso, melón y las especies silvestres seleccionadas. Información de contacto: aatares@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________________________________ Investigador: Marcos De la Peña Proyecto: Caracterización funcional de RNAs circulares con ribozimas codificados en genomas de plantas. En nuestro laboratorio hemos descrito recientemente una curiosa familia de retroelementos con ribozimas (los Retrozimas, Cervera et al. Genome Biol 2016) distribuidos ampliamente en multitud de genomas de plantas. Dichos retrotransposones se acumulan abundantemente en el transcriptoma de la célula vegetal como pequeños (600-1000 nt) RNAs no codificantes circulares, característica que los hace únicos y que sugiere que podrían desempeñar diversos papeles biológicos en las plantas que los contienen. El objetivo de este Trabajo Fin de Máster será llevar a cabo una caracterización molecular de dichos RNAs circulares, tanto en sus huéspedes naturales como en sistemas modelo (N. benthamiana y A. thaliana) mediante transformación genética con diversas construcciones de retrozimas. El trabajo permitirá aprender y utilizar las técnicas y herramientas multidisciplinares empleadas en nuestro laboratorio, y en las que fundamentalmente se combina Bioinformática, Bioquímica y Biología Molecular y Estructural de ácidos nucleicos en plantas. Información de contacto: rivero@ibmcp.upv.es _____________________________________________________________________________________ Investigador: Vicente Moreno Proyecto: Mutagénesis insercional en tomate En este trabajo utilizaremos la mutagénesis insercional como herramienta para la identificación de genes clave implicados en el desarrollo del fruto de tomate, así como alguno de los genes que determinan la tolerancia al estrés salino e hídrico, tanto en tomate (moderadamente tolerante a la sal) como en diversas especies silvestres relacionadas (accesiones muy tolerantes al estrés hídrico y salino). Con esta estrategia, los genes quedan etiquetados por el T‐DNA, lo que facilita considerablemente el proceso de clonación. En nuestro grupo disponemos de una amplia colección de líneas de inserción y de mutantes previamente identificados con los que poder abordar el trabajo planteado. Información de contacto: vmoreno@ibmcp.upv.es _____________________________________________________________________________________________ Investigador: Benito Pineda Proyecto: Etiquetado de genes en especies silvestres relacionadas con el tomate Los diferentes estreses, tanto bióticos como abióticos, a los que se ven sometidas las plantas cultivadas son una de las principales causas de las bajadas en su rendimiento y calidad. Diversas especies silvestres relacionadas con el tomate presentan una mayor tolerancia a estos tipos de estrés que las variedades de tomate cultivadas. En este trabajo utilizaremos una herramienta genómica, el etiquetado de genes, en varias especies silvestres relacionadas con tomate para identificar secuencias codificantes o elementos de regulación de genes de interés para la mejora. Información de contacto: bpineda@btc.upv.es ________________________________________________________________________________________ Investigador: Lynne Yenush y JM Mulet Proyecto: Identificación de rasgos fisiológicos y moleculares distintivos en variedades de melón sensibles y tolerantes a estrés abiótico. El melón (Cucumis melo) es uno de los cultivos con mayor interés comercial en España. Sin embargo su cultivo precisa de mucha agua que es un elemento limitante en las zonas donde se da la mayor producción, que suelen verse afectadas por sequías o por la salinización de las aguas de riego. Por técnicas de mejora genética se han caracterizado variedades sensibles o tolerantes a diferentes tipos de estrés abiótico, sin embargo la base molecular que explica esta tolerancia no es desconocida. En el presente TFM, identificaremos las características proteómicas o metabolómicas distintivas entre variedades previamente caracterizadas como sensibles o tolerantes a sequía y/o salinidad. Una vez identificadas se buscarán estas características en variedades no caracterizadas previamente y se valorará su poder predictivo. Información de contacto: jmmulet@ibmcp.upv.es ________________________________________________________________________________________ Investigadores: Miguel A. Pérez-Amador y María Dolores Gómez Proyecto: Estudio de la función de las giberelinas en la iniciación y desarrollo de los óvulos en Arabidopsis Las giberelinas (GAs) son hormonas vegetales que regulan multitud de procesos fisiológicos tales como germinación, elongación del tallo, fotomorfogénesis, crecimiento de la hoja y de la raíz, floración, desarrollo del polen y fructificación. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que las GAs también están implicadas en la iniciación de los óvulos determinando tanto el número como la forma de éstos. En las últimas décadas, se han identificado numerosos genes implicados en la determinación de la identidad de los óvulos y en su desarrollo. Sin embargo, se conoce muy poco sobre qué genes determinan el número de óvulos. Desde un punto de vista económico y agronómico, es importante determinar cuáles son estos factores ya que el número de óvulos determina en gran medida el número de semillas y por tanto afecta al rendimiento de los cultivos. Nuestro objetivo es comprender cómo las GAs regulan la iniciación y desarrollo de los óvulos de Arabidopsis y de otras especies de interés agronómico, y cómo la vía de señalización de GAs interactúa con las vías de señalización de auxinas, citoquininas y brasinoesteroides que también participan en este proceso de desarrollo. El trabajo de máster podrá realizarse en diversas líneas de trabajo: a) caracterización de genes dianas de GAs identificados mediante RNAseq en óvulos de Arabidopsis; b) la caracterización morfológica de los óvulos y semillas en plantas con mutaciones en genes de la ruta de señalización de GAs y c) estudio molecular de la interacción de la ruta de señalización de GAs con otras rutas hormonales. La realización del proyecto conllevará el aprendizaje de técnicas de biología molecular y microscopía. Información de contacto: mpereza@ibmcp.upv.es, mdgomez@ibmcp.upv.es ________________________________________________________________________________________ Investigador: Pedro Luis Rodríguez Egea Proyecto: Regulación de la señalización del ABA y tolerancia a sequía mediante E3 ubiquitín ligasas que regulan el recambio de fosfatasas 2C La sequía es una limitación muy importante para la productividad de los cultivos. La agricultura representa el 70% del consumo total de agua y se prevé que las necesidades mundiales de agua superen el suministro sostenible de agua en un 40% para el año 2030. El impacto del calentamiento global sobre los patrones climáticos y las precipitaciones podría reducir el rendimiento de los cultivos al menos un 25% y por lo tanto se requiere el desarrollo de estrategias para mejorar el rendimiento de los cultivos bajo déficit hídrico. En este escenario, el ácido abscisico (ABA) es una fitohormona que juega un papel clave ya que controla la eficiencia en el uso del agua por la planta a través de la regulación de la apertura estomática y mediante ajustes a largo plazo que resultan en el mantenimiento de la asimilación neta de carbono. La ruta de transducción del ABA es crítica en la fisiología de la respuesta al estrés por sequía y para desarrollar una mayor eficiencia en el uso del agua. Por ello, la regulación del recambio y la vida media de los componentes centrales de señalización del ABA tendrá un gran impacto en la respuesta de la planta a la sequía La ubiquitinación es una modificación postraduccional de proteínas que controla numerosos procesos fisiológicos. En las plantas, tanto las respuestas de estrés biótico como abiótico, así como la respuesta hormonal, son reguladas por la maquinaria de ubiquitinación, la cual controla la vida media de los componentes críticos para la señalización. Diversos tipos de ubiquitinación conducen a diversos destinos de las proteínas diana, tales como la degradación por el proteasoma 26S o bien a través del sistema ESCRT y degradación vacuolar. Recientemente hemos desempeñado un papel pionero (Bueso et al., 2014; Irigoyen et al., 2014; Wu et al., 2016; Belda-Palazon et al., 2016, 2018, 2019; Garcia-Leon et al., 2019; Julian et al., 2019) en los estudios que han identificado componentes de la maquinaria de ubiquitinación claves para regular la vida media de fosfatasas tipo 2C (PP2Cs), las cuales son los principales reguladores negativos de la ruta del ABA, y de los receptores de ABA. Como resultado de ello hemos identificado E3 ligasas que tienen como diana a las PP2Cs y los receptores de ABA. En el proyecto vamos a caracterizar y explorar el uso biotecnológico de las mismas para regular la reforzar la tolerancia a sequía. El proyecto conlleva el uso de técnicas de genética, biología molecular, bioquímica y bioinformática. Más información y publicaciones del grupo en: http://www.ibmcp.csic.es/es/personas/pedrorodriguezcsices https://www.researchgate.net/profile/Pedro_Rodriguez11/citations?sorting... Información de contacto: prodriguez@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________________________________ Investigadores: Regina Niñoles y Jose Gadea Proyecto: Caracterización funcional de mutantes implicados en la longevidad de semillas. La longevidad de la semilla es el tiempo que puede mantenerse almacenada sin perder su viabilidad o potencial de germinación. Este factor tiene no sólo interés agronómico sino también para el mantenimiento de la biodiversidad. Las semillas van perdiendo gradualmente viabilidad durante el almacenamiento y las empresas productoras de semillas demandan mecanismos para retrasar ese “envejecimiento”, que depende tanto de factores ambientales como genéticos. Trabajos anteriores del laboratorio han identificado varios mutantes de Arabidopsis que presentan una longevidad de semilla alterada. Entre otros, el mutante tt7 tiene afectado un enzima de biosíntesis de flavonoides, y presenta una extrema sensibilidad al envejecimiento. Su caracterización ha corroborado que la testa de la semilla juega un papel muy relevante en el mantenimiento de su viabilidad ya que actúa de barrera frente a agresiones externas. Por el contrario, el mutante ssf (cuya mutación genética aún no se conoce) presenta una elevada viabilidad, que parece asociada a la mayor acumulación de proteínas de reserva en la semilla. En este Trabajo Final de Máster se continuará con la caracterización funcional de estos mutantes, para profundizar en el mecanismo de acción de cada uno de los genes en este proceso, tratando de responder a preguntas como: ¿Cuál es la causa de la alteración de la cubierta de tt7? ¿Se debe a su variación en la composición de flavonoides o a su desajuste hormonal? ¿Cuál es realmente la importancia de las proteínas de reserva en la longevidad de semillas? ¿Qué gen está afectado en el mutante ssf? Con este planteamiento, las técnicas a emplear en el TFM incluyen: - Manejo de organimos modelo como Escherichia Coli, Arabidopsis thaliana o Nicotiana benthamiana - Técnicas de Biología Molecular: PCR, electroforesis de ácidos nucleicos, qRT-PCR, genotipado de mutantes, clonaciones. - Técnicas genéticas: Cruces genéticos, selección de mutantes y dobles mutantes. - Caracterización fenotípica de mutantes, incluyendo ensayos de envejecimiento acelerado. - Manejo del microscopio confocal. Por lo tanto, en este trabajo se investigará sobre los factores genéticos que determinan la longevidad de la semilla, con el fin último de obtener semillas capaces de mantenerse viables por más tiempo. Información de contacto: renioro@upvnet.upv.es; jgadeav@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________________________________ Investigador: Concha Gómez Mena y José Pío Beltrán. Proyecto: Estudio de los mecanismos moleculares de la producción de frutos sin semillas en tomate. El desarrollo del ovario en un fruto (cuajado del fruto) depende de que ocurra la polinización y fertilización del mismo y puede verse comprometido por condiciones ambientales desfavorables. Sin embargo, en algunas especies el cuajado del fruto puede desacoplarse de la fertilización generando así frutos sin semillas (partenocárpicos). La partenocarpia es un carácter apreciado en la industria y a la vez, una herramienta valiosa para dilucidar las bases genéticas y moleculares que controlan el proceso de cuajado del fruto. En el laboratorio hemos aislado un mutante estéril de tomate (hydra) cuya mutación está asociada a la producción de frutos sin semillas (partenocárpicos). El gen HYDRA ha sido clonado (Rojas-Gracia et al 2017) y codifica una proteína represora que controla el inicio de la esporogénesis y por tanto la formación de los gametos. Mediante el análisis de genotipos partenocárpico hemos podido demostrar una correlación entre la esterilidad masculina y el desarrollo del ovario en ausencia de fertilización. El proyecto en el que se enmarcaría el TFM pretende estudiar el potencial de la esterilidad masculina en la obtención de partenocarpia en tomate. Para ello se generarán líneas estériles de tomate mediante edición genética utilizando la tecnología CRISPR/Cas9. La participación en este proyecto implica la utilización de técnicas de Biología Molecular, microscopía y transformación genética de plantas. Información de contacto: cgomezm@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________________________________ Investigador: Vicente Pallas Proyecto: Descrifrando interacciones virus-planta esenciales para la susceptibilidad y/o resistencia en el virus del cribado del melon Los virus de plantas siguen siendo una de las principales amenazas para los cultivos agrícolas. Las pérdidas económicas ocasionadas por estos patógenos se han estimado en 50.000 millones de euros por año en todo el mundo. Esta situación podría incluso empeorar dadas las nuevas condiciones medioambientales ocasionadas por el actual cambio climático. Debido a la naturaleza biotrófica de los virus de plantas, estos patógenos necesitan tejido vivo para su multiplicación y por lo tanto su proceso de infección debe implicar numerosas interacciones entre los componentes del virus (ARN y proteínas) y el huésped (ARN, proteínas, lípidos, membranas). Estas interacciones pueden facilitar o por el contrario limitar/contrarrestar la infección del virus. Los fenotipos patológicos son el resultado de la interferencia y/o competición por una cantidad sustancial de los recursos del huésped lo que puede derivar en una disfunción de la fisiología del mismo y causar la enfermedad. Durante los últimos años nuestro Grupo ha iniciado una línea de investigación consistente en tratar de descifrar las interacciones que ocurren entre proteínas virales y factores del huésped que son esenciales para la susceptibilidad o la resistencia del huésped. Para abordar estos estudios estamos trabajando con dos patosistemas diferentes: el virus del cribado del melón (MNSV)/plantas de melón y el virus del mosaico de la alfalfa (AMV)/arabidopsis. MNSV y AMV afectan muy significativamente a las cucurbitáceas por una parte (MNSV) y a las solanáceas y leguminosas por otra (AMV). El patosistema MNSV/melón ha emergido en los últimos años como un modelo de referencia para el estudio del movimiento intracelular de los virus por un lado y para los estudios de la resistencia genética, por otro. Por otra parte, el AMV y los ilarvirus son objetos indispensables para el estudio de la multifuncionalidad de las proteínas de cubierta (CP). Como continuación de los proyectos anteriores en esta propuesta queremos descifrar las principlaes interacciones de las proteínas de movimiento del MNSV y las CPs del MNSV y del AMV, respectivamente, con factores del huésped que condicionan la infección de estos dos virus en sus huéspedes respectivos. Tanto las MPs como las CPs no solo se requieren para los procesos de transporte o encapsidación del genoma viral, respectivamente, sino que constituyen efectores universales del proceso patogénico a través de interacciones directas o indirectas con factores y/o rutas endógenas. Recientemente hemos obtenido una sólida evidencia de que el MNSV usurpa la ruta de translocación intracelular hacia los cloroplastos/mitocondrias y por otra parte hemos observado los primeros indicios para un virus de plantas (AMV) de que pueden utilizar la ruta de modificación postranscripcional del RNA tipo N6-metiladenosina (m6A) como un nuevo mecanismo regulador en su ciclo biológico. El objetivo general del presente Proyecto es descifrar el mecanismo de reconocimiento que las proteínas virales utilizan para usurpar la ruta de señalización dual hacia cloroplastos y mitocondrias. Estos estudios pueden ayudar al desarrollo de nuevas estrategias antivirales y a predecir la durabilidad de las resistencias. Información de contacto: vpallas@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________________________________ INVESTIGADORES: Eduardo Bueso y Ramón Serrano Proyecto: Identificación de factores de transcripción que regulan la longevidad de semillas vía AtHB25 y COG1 mediante rastreo por “one hybrid”. En nuestro grupo de investigación se han identificado dos factores de transcripción que alargan la vida útil de las semillas, una de las características más apreciadas tanto por las empresas de agricultura como por las Instituciones implicadas en la conservación de la Biodiversidad. Estos factores de transcripción son COG1 y AtHB25 que principalmente regulan el crecimiento de la cubierta de la semilla. Sin embargo estos genes tienen a su vez reguladores más importantes agua arriba. Para identificarlos proponemos un rastreo con una librería de cDNA que cubre el 75% de todos los factores de transcripción de Arabidopsis. Para el rastreo utilizaremos la técnica de “one hybrid” y un gen reportero nos facilitará la detección de los candidatos. Lo único que nos falta es una persona como tú que le entusiasme la Biología Molecular. Además se promete el mejor ambiente del IBMCP. L@s alunm@s interesados pueden dirigirse al laboratorio 1.10 para conocer mejor todos los detalles. Información de contacto: edbuero@ibmcp.upv.es; gaetano.bissoli@mail.com ________________________________________________________________________________________ INVESTIGADOR: José Antonio Darós Proyecto: Control de la expresión génica en plantas mediante la aplicación exógena de RNA El silenciamiento génico mediado por RNA o interferencia por RNA (RNAi) es un conjunto de mecanismos de regulación de la expresión génica presente en la mayoría de grandes grupos taxonómicos, entre ellos las plantas, que tienen como elementos clave moléculas pequeñas de RNA (sRNA) de secuencia altamente complementaria a la de los genes silenciados. En plantas, el mecanismo cumple funciones tan diversas como el mantenimiento de la estabilidad del genoma, la regulación del desarrollo, la adaptación al medio o la defensa frente a patógenos, y puede desencadenarse tanto a partir de la expresión de genes endógenos, como los de los microRNAs (miRNAs), o de RNAs exógenos, como los genomas o transcritos de virus invasores. La sencillez del mecanismo que dota de especificidad al RNAi, simple complementariedad de bases de los sRNAs, ha propiciado la aparición de un gran número de desarrollos biotecnológicos que van desde plantas resistentes a determinados patógenos hasta plantas en las que la expresión de algunos de sus genes endógenos ha sido alterada. Sin embargo, todas ellas son plantas modificadas genéticamente que han despertado cierta alarma social en su comercialización. En este trabajo de fin de máster contribuiremos al desarrollo de estrategias para aprovechar las potencialidades biotecnológicas del RNAi en plantas, sin necesidad de modificarlas genéticamente. Para ello investigaremos las posibilidades de administrar RNAs bicatenarios (dsRNAs), que inducen con mucha eficiencia RNAi, así como precursores de miRNAs artificiales (amiRNAs) y sRNAs interferentes transactivos (tasiRNAs) sintéticos (syn-tasiRNAs) a los tejidos de las plantas mediante aplicación exógena utilizando nanopartículas, con el objetivo de inducir cambios en la expresión de genes endógenos. Se diseñarán construcciones genéticas para expresar dsRNAs y precursores de amiRNAs y syn-tasiRNAs contra los genes reporteros CLA1 y Sulphur de Nicotiana benthamiana. El silenciamiento de ambos genes produce un fenotipo de amarilleamiento fácil de monitorizar. Una vez realizadas las construcciones genéticas, los RNAs a ensayar se producirán en reacciones de trascripción in vitro y mediante un novedoso sistema biofactoría, propio del grupo, en cultivos de Escherichia coli. Los RNAs se purificarán y se aplicarán sobre las plantas de N. benthamiana, tanto desnudos como asociados a diferentes nanomateriales, más concretamene nanohojas de arcilla y nanopartículas de sílice mesoporoso. Se analizará el grado de silenciamiento de los genes de la planta en función de cada tipo y concentración de RNA, así como del modo de administración. La aplicación de RNAs exógenos en agricultura puede ser una alternativa a los fitosanitarios y fitoreguladores de síntesis química más específica, sostenible y respetuosa con el medio ambiente. Información de contacto: jadaros@ibmcp.upv.es ________________________________________________________________________________________ Investigador: Jesús Ángel Sánchez-Navarro Proyecto: Desarrollo de vectores virales para el silenciamiento de genes de interés en planta. El silenciamiento génico o conjunto de mecanismos que impiden que un gen específico se transcriba, representa una herramienta muy útil que puede ser aplicada en diferentes áreas de biotecnología de plantas, biología celular, etc. El silenciamiento de genes actúa a dos niveles: silenciamiento génico transcripcional (Transcriptional Gene Silencing o TGS) y silenciamiento génico post-transcripcional (Post-Transcriptional Gene Silencing o PTGS). Los mecanismos de TGS incluyen modificaciones epigenéticas de regiones promotoras o alteraciones de la cromatina, que permiten el bloqueo de la transcripción de un determinado gen. En el caso del silenciamiento PTGS, los mecanismos actúan directamente sobre el RNA mensajero, induciendo su degradación o el bloqueo de su traducción, utilizando para ello moléculas de RNA de pequeño tamaño (de 20 a 25 residuos de nucleótidos) denominadas RNA de interferencia o RNAi. Gracias a estos mecanismos las células modulan la expresión génica de su propio ADN y además intentan evitar la expresión de genes que no son propios (genes de parásitos intracelulares como virus, bacterias y otros eucariotas). Existen diferentes formas de inducir el silenciamiento de un determinado gen incluyendo la sobreexpresión del gen diana, la expresión de regiones del gen como RNA de doble cadena o la utilización de secuencias reguladoras basadas en microRNAs (miRNA), dirigidas al gen de interés, entre otras. Sin embargo, estos métodos dependen de la transformación y regeneración mediada por Agrobacterium, en donde la eficacia de la transformación y las tasas de éxito de la regeneración son factores limitantes, observándose especias vegetales que no se han podido transformar o donde el proceso global puede requerir hasta varios años. Una alternativa al silenciamiento génico mediado por transformación por Agrobacterium, lo representa el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS). Los virus de plantas presentan intermediarios de replicación de doble cadena de RNA, que inducen muy eficientemente el silenciamiento génico durante la infección. La disponibilidad de clones infecciosos de virus de plantas, que permiten la introducción de secuencias de exógenas, ha posibilitado el silenciamiento de genes del huésped, en plazos de tiempo muy reducidos (días). Sin embargo, la utilización de VIGS ha estado condicionada por la disponibilidad de clones infecciosos de virus que afecten especies de interés o que se acumulen en determinados tejidos. En el laboratorio disponemos de clones infecciosos para el virus del mosaico de la alfalfa (AMV; género Alfamovirus), el virus del mosaico del melocotonero (PcMV; género Trichovirus) y el virus latente del clavel (CLV; género Carlavirus). Recientemente, hemos averiguado cómo modificar una de las proteínas del virus (proteína de movimiento, MP) sin afectar a su funcionalidad, permitiendo introducir secuencias de interés de hasta 200 residuos de nucleótidos. En el presente proyecto TFM abordaremos el desarrollo de los clones infecciosos de AMV, PcMV y/o CLV para su utilización como VIGS. Información de contacto: jesanche@ibmcp.upv.es ______________________________________________________________________________________________ Investigadores: Esther Carrera Proyecto: Ensayos de la respuesta de MicroTom a estreses abióticos, como vía para el estudio del desacople del crecimiento y defensa en plantas de tomate. Las giberelinas (GAs) y los inhibidores de su biosíntesis pueden constituir una herramienta para mejorar aspectos agronómicos. Sin embargo, la aplicación de estos compuestos provoca efectos secundarios no deseados en todo tipo de cultivos. Así pues, resulta interesante la obtención de variedades que mejoren aspectos de interés agronómico sin provocar efectos colaterales como la inhibición del crecimiento de la planta durante su adaptación al estrés abiótico. El trabajo a realizar forma parte del proyecto Prometeo cuyo objetivo es desacoplar la función de la DELLA de tomate (PRO), en tolerancia a estrés de sus efectos en inhibición de crecimiento. El objetivo TFM que se ofrece se encuentra relacionado con la puesta a punto de ensayos de estrés en plantas de tomate para optimizar la participación de la proteína DELLA PRO y ver que la pérdida de función de PRO manifieste sensibilidad y su estabilización cause resistencia. Para ello, se realizarán ensayos de tolerancia a sal y resistencia a patógenos, utilizando la variedad Microtom de tomate tratada con GA3 o con paclobutrazol (para provocar menor o mayor estabilización de PRO respectivamente), así como con la línea pro de pérdida de función de DELLA PRO. Proponemos un proyecto TFM para realizar - Tratamientos hormonales y caracterización fenotípica de las plantas sin ser sometidas a estreses abióticos. - Ensayos de tratamientos abióticos con la aplicación de NaCl, inoculación de esporas de hongos o de sensibilidad al ácido jasmónico. - Análisis fenotípico de la necrosis foliar, producción ROS, productividad o de antocianinas, en plantas sometidas a estrés. - Análisis por RT-qPCR de la expresión de genes de respuesta a estrés. - Determinación de volátiles en el Servicio de Metabolómica. Este trabajo está enmarcado en un proyecto Prometeo, cuyo objetivo es desacoplar la función de la DELLA de tomate, en tolerancia a estrés de sus efectos en inhibición de crecimiento. Información de contacto: ecarrera@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________________________________ Investigador: Francisco Vera Proyecto: Nuevos reguladores del crecimiento lateral en plantas. El sistema vascular de las plantas consiste en una compleja red de tejidos que permiten el transporte de agua y moléculas hacia los órganos donde son requeridas. Por ello, el desarrollo vascular es importante para un correcto crecimiento de las plantas. Uno de los factores que intervienen en este proceso, a nivel de señalización celular, son las hormonas vegetales. En concreto las estrigolactonas son una familia de fitohormonas que hasta ahora eran conocidas por sus efectos sobre la rizosfera y sobre la ramificación, pero que recientemente se han implicado también en el desarrollo vascular. Hasta ahora, se sabe que las estrigolactonas están implicadas en la regulación de la proliferación celular en el cambium vascular, pero se ignora si además regulan la adquisición de patrones específicos en la vasculatura. En este trabajo, se pretende caracterizar de un modo preciso cuales son los efectos a nivel de vasculatura que produce la ausencia de D14, receptor de estrigolactonas, en Arabidopsis thaliana. Información de contacto: fravesi@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________________________________ Investigador: Javier Agustí Proyecto: Biotecnología en Yuca Se estima que en 2050 la población mundial será de 10.000 millones de personas. Es previsible que este aumento de la población afecte especialmente a los países en desarrollo, comprometiendo seriamente su disponibilidad de alimentos. La yuca (Manihot esculenta) es la planta más cultivada en el África sub-Sahariana, donde alimenta a, aproximadamente, 800 millones de personas (FAO, 2015). La facilidad de su cultivo y su resistencia a altas temperaturas y a la sequía convierten a la yuca en el cultivo ideal (y, en la mayoría de casos, el único posible) para pequeños agricultores. La parte comestible de la yuca es su raíz de reserva, especializada en la acumulación de almidón. El estudiante que se incorpore a este proyecto colaborará en el desarrollo de nuevas herramientas biotecnológicas para la mejora de la yuca. Para ello, el estudiante participará activamente en la caracterización molecular de nuevos genes que, potencialmente, regulan el desarrollo de la raíz de reserva de la yuca, con vistas a generar nuevas líneas (transgénicas) utilizando dichos reguladores. Este trabajo está enmarcado en un proyecto cuyo objetivo final es la mejora de la producción del cultivo. Información de contacto: jagusti@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________________________________ Investigador: Javier Gallego-Bartolomé y David Alabadí. Proyecto: Identificación de los complejos transcripcionales que interaccionan con la RNA polimerasa II durante la respuesta a luz La mayor parte de la información sobre regulación transcripcional en plantas está basada en la caracterización de factores de transcripción. Sin embargo, no se conoce muy bien cómo estos factores de transcripción regulan la actividad de la maquinaria basal de transcripción, por ejemplo, de la RNA polimerasa II (RNAPII). Investigaciones en levaduras y animales indican que la actividad de la maquinaria basal está sujeta a una estrecha regulación mediante interacción con numerosos factores proteicos, y que esto es especialmente importante a la hora de promover una respuesta transcripcional rápida a estímulos, externos o endógenos. En particular, la luz ejerce una influencia enorme en la vida de la planta y cambios en el ambiente luminoso –transiciones de luz/oscuridad, o cambios en la cantidad o calidad de la luz- provocan cambios masivos en el transcriptoma y reorganizaciones en la cromatina. En este proyecto para TFM proponemos la identificación de los complejos de la RNAPII que se ensamblan específicamente en respuesta a luz y lo abordaremos utilizando suspensiones celulares de Arabidopsis como sistema experimental. Este sistema te permite obtener grandes cantidades de biomasa muy homogénea, que supone una ventaja frente a la heterogeneidad que ofrecen las plántulas enteras. El proyecto que proponemos incluye: 1) Caracterización de la respuesta a la luz de suspensiones celulares previamente cultivadas en oscuridad (etioladas): cinéticas de expresión de genes y de acumulación de metabolitos marcadores. 2) Preparación de construcciones para etiquetar varias subunidades específicas de RNAPII y generación de líneas celulares transgénicas. 3) Análisis funcional de las proteínas etiquetadas en respuesta a luz: inmunoblots para determinar el tamaño y acumulación de las proteínas, co-inmunoprecipitaciones (IP) para determinar el ensamblaje correcto de la RNAPII etiquetada y ensayos de unión a los genes marcadores por IP de cromatina. 4) Experimento piloto de IP e identificación de proteínas co-inmunoprecipitadas por espectrometría de masas, comparando suspensiones cultivadas en oscuridad frente al tratamiento por luz (según 1 y 3). Información de contacto: jagalbar@ucla.edu; dalabadi@ibmcp.upv.es ______________________________________________________________________________________________ Investigadores: Vicente Balanzà, Cristina Ferrándiz. Proyecto: Comer en tiempos revueltos: Identificación de factores en el control del final de la floración. Según Naciones Unidas, la población mundial ha estado aumentando de forma gradual hasta la actualidad y se espera que alcanzar los 9700 millones de personas en el 2050 (2100 millones más que en a actualidad). Hasta la fecha se ha asegurado la alimentación de esta población mediante el incremento de la producción agraria mundial, mejorando los rendimientos de nuestros cultivos, pero en gran medida también aumentando la superficie destinada a la agricultura y la ganadería. Lamentablemente la superficie cultivable en el planeta es limitada, y las consecuencias del cambio climático (aumento de la temperatura, sequia, erosión,…) están ya provocando la perdida de miles de hectáreas cultivables. Ante este escenario, el desarrollo de plantas mas productivas y mejor adaptadas a las nuevas condiciones climáticas son una prioridad para la comunidad científica. La producción de flores/frutos/semillas de los cultivos utilizados depende en gran medida de la actividad de los meristemos inflorescentes que las plantas desarrollan durante la etapa reproductiva, y en consecuencia, del tiempo que dura esta actividad. Sorprendentemente, los factores que controlan la duración de la etapa reproductiva apenas se han estudiado. Uno de los objetivos principales de nuestro laboratorio es la identificación y caracterización de los mecanismos moleculares que controlan este proceso teniendo como propósito final la mejora de plantas de interés agronómico: retrasar el final de la floración supone incrementar el numero de flores/frutos/semillas producidos incrementando el rendimiento de las explotaciones agrarias. En plantas, el final de la etapa reproductiva esta controlado principalmente por dos mecanismos. Uno de ellos ha sido recientemente descrito por nuestro grupo, identificando una ruta génica dependiente de la edad que controla la actividad del meristemo inflorescente al final de la floración: La ruta FRUITFULL-APETALA2 (FUL-AP2) (Balanzà et al. 2018). El otro mecanismo está controlado y depende del numero de semillas producido por la planta. Aunque este mecanismo se conoce desde hace mas de un siglo, las bases moleculares que lo gobiernan todavía son desconocidas. Se ha propuesto que el control del final de la floración ejercido por las semillas dependería, entre otros factores, a la existencia de una posible “hormona de la muerte”. Esta hormona de la muerte sería una señal móvil generada en las semillas que afectaría al funcionamiento del meristemo inflorescente y que una vez alcanzados unos niveles determinados desencadenaría el final de la floración suprimiendo la actividad meristemática. Una hipótesis que barajamos en el laboratorio es que la producción o la actividad de esta “hormona de la muerte” podría estar fuertemente influenciada por factores ambientales como la sequía, la luz o la temperatura, y que se prevé que cambiaran considerablemente en los próximos años. Actualmente hemos identificado diferentes candidatos que podrían estar funcionando como la descrita “hormona de la muerte” generada por las semillas, entre los que se encuentran pequeñas proteínas móviles y miRNAs. De este modo, el TFM que proponemos consiste en la caracterización fenotípica y molecular de mutantes para estos candidatos en diferentes condiciones de crecimiento, como en presencia o ausencia de semillas, en respuesta a diferentes rangos de temperatura o diferentes grados de sequia. Estos análisis se combinaran con el estudio de sus patrones de expresión mediante hibridación in situ y análisis de marcadores moleculares (tinciones GUS, microscopia confocal). Por último, se analizara como estos posibles candidatos interaccionan o se integran a nivel de la ruta FUL-AP2, mediante la generación de combinaciones de mutantes y el análisis de líneas marcadoras. Información de contacto: vbalanza@ibmcp.upv.es, cferrandiz@ibmcp.upv.es. ________________________________________________________________________________________ Investigadores: Francisco Madueño y Reyes Benlloch Proyecto: Análisis de la conexión entre la formación de las flores y el estrés abiótico (ABA) a través de TERMINAL FLOWER 1 La regulación del inicio de la floración y la formación de las flores son procesos críticos para el éxito reproductivo de la planta y, a su vez, son determinantes clave de la productividad de los cultivos. En el laboratorio, estudiamos la red genética que controla el tiempo de la floración y la arquitectura de la inflorescencia. El gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) juega un papel esencial en dicha red, regulando el inicio de la floración y el funcionamiento del meristemo apical de la inflorescencia. Así, las plantas mutantes en TFL1 florecen más pronto y son determinadas, es decir el crecimiento del tallo de su inflorescencia se para, ya que se forma una flor terminal. Esto da lugar a variedades más bajas y más compactas que se utilizan en muchas especies (tomate, leguminosas, brasicas) para faciltar la recolección mecanizada. Se conoce muy poco del modo de acción de TFL1, de qué manera regula la floración y la determinación. Recientemente, mediante experimentos de RNA-seq y ChIP-seq, hemos identificado los genes que son regulados por TFL1. Una parte significativa de ellos codifica proteínas centrales en la ruta de señalización del ácido abcísico (ABA), lo que ha revelado una conexión desconocida e inesperada entre la regulación de la formación de las flores y el ABA, hormona clave en procesos de estrés abiótico, especialmente en el estrés hídrico. El proyecto que proponemos tiene como objetivo entender cómo actúa TFL1 a traves de la ruta del ABA para controlar el desarrollo de la planta. Para ello, estudiaremos con detalle la expresión de varios de esos genes del ABA en diferentes fondos mutantes de TFL1 y aislaremos y generaremos líneas mutantes y de sobreexpresión de los mismos, que caracterizaremos con detalle para diferentes aspectos del desarrollo. El proyecto conlleva el uso de técnicas de genética directa y reversa, biología molecular, y microscopía. Información de contacto: madueno@ibmcp.upv.es; reyes.benlloch@ibmcp.upv.es ________________________________________________________________________________________ Investigador: Diego Orzáez y Marta Vázquez. Proyecto: Edición génica mediada por recombinación homóloga en N. benthamiana vía CRISPR-Cas12a La tecnología CRISPR ha revolucionado el campo de la edición genómica de plantas en los últimos años. Las mellas en el ADN introducidas por las endonucleasas del sistema CRISPR pueden ser reparadas por dos vías diferentes: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). La reparación mediada por HR permite la introducción de ADN en una localización concreta del genoma. Esto permite, a diferencia del NHEJ editar el genoma no solo en la posición deseada, sino también con los cambios deseados. Sin embargo, los mecanismos de HR son muy ineficiente en plantas. Recientemente se han planteado una serie de estrategias destinadas a conseguir mejoras en la eficiencia de reparación homóloga. Una de ellas es la sobreexpresión de enzimas implicadas en el proceso de HR. Otra, la amplificación del número de moléculas de la secuencia donadora mediante el uso de vectores virales como geminivirus. El aumento de la cantidad de enzimas mediadoras de HR junto con la presencia de un gran número de moléculas del ADN donador en el punto de la rotura del genoma se espera que mejoren la eficiencia de HR permitiendo la obtención de plantas editadas. Para probarlo se elegirán dos genes como dianas de la HR, la acetolactato sintasa (ALS) y un factor de transcripción tipo MYB involucrado en la síntesis de antocianos. Mutaciones en la ALS confieren resistencia a herbicidas, mientras la sobreexpresión del MYB lleva a la acumulación de antocianos. El trabajo está enmarcado en un proyecto cuyo objetivo final es la mejora de N. benthamiana y N. tabacum para su uso en la producción de proteínas y compuestos de interés industrial. Proponemos un proyecto que combina trabajo de: -biología molecular, generación de varias construcciones génicas que incluirán la endonucleasa, los ARN guías y la secuencia donadora utilizando la tecnología de ensamblaje de ADN Golden Gate. - biotecnología vegetal, generación de líneas transgénicas de N. benthamiana con las construcciones génicas obtenidas. - genéticos y enzimáticos, genotipar y caracterizar funcionalmente las líneas generadas. Información de contacto: dorzaez@ibmcp.upv.es; marvazvi@ibmcp.upv.es ________________________________________________________________________________________ Investigador: Diego Orzáez y Sara Selma. Proyecto: Diseño de represores transcripcionales sintéticos basados en CRISPR-Cas9 en N. benthamiana Las nuevas tecnologías basadas en las nucleasas específicas de secuencia CRISPR-Cas han revolucionado los campos de la biología sintética y la ingeniería metabólica al permitir el desarrollo de herramientas eficientes y precisas. El sistema CRISPR-Cas9 se basa en la acción de una nucleasa tipo Cas a la que se asocia un pequeño guía de ARN que portará la secuencia complementaria a la diana de ADN a la que queremos dirigir la proteína. La especificidad que ofrece este sistema ha hecho que su uso esté ampliamente extendido, con gran número de aplicaciones. En el campo de la biotecnología vegetal se ha utilizado de forma eficaz para la edición de genes, generación de “Knock outs” o para la creación de reguladores transcripcionales sintéticos. El uso del sistema CRISPR-Cas9 como regulador transcripcional sintético se ha conseguido gracias al uso de una proteína Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9). Mediante el uso de ARN guías es posible el dirigir a la proteína dCas9 a la región promotora de un gen seleccionado y regular su expresión. Trabajos previos en nuestro grupo han conseguido obtener una activación transcripcional eficiente en un gen o grupo seleccionado de genes en N. benthamiana mediante variaciones y estrategias de fusión de distintos activadores transcripcionales a dCas9 o su guía de ARN. Sin embargo, la represión transcripcional supone un reto y es necesaria para la futura obtención de circuitos de regulación transcripcional eficientes. Al estudiante que se incorpore en nuestro grupo se le propone la puesta a punto de la represión transcripcional en N.benthamiana mediante el uso del sistema CRISPR-Cas9. Para ello se abordarán distintas estrategias de fusión de dominios de represión a dCas9, así como la incorporación de modificaciones tanto en la estructura de la proteína como de su guía de ARN para favorecer el reclutamiento de más represores de la transcripción. Información de contacto: dorzaez@ibmcp.upv.es , saselgar@doctor.upv.es ________________________________________________________________________________________ Investigador: Maite Sanmartín Proyecto: Regulación de la diferenciación celular en plantas Las plantas tienen la capacidad de adaptar sus programas de desarrollo para hacer frente a cambios ambientales, que en ocasiones son adversos, con el fin de asegurarse su supervivencia. Para modificar estos programas de desarrollo, es necesaria una regulación precisa de la expresión génica que está coordinada, en gran parte, por alteraciones en la organización y modificación de la cromatina y la actividad de factores de transcripción. Ambos procesos desempeñan, por tanto, un papel fundamental en el control espacio-temporal de los patrones de expresión de un conjunto de genes permiten que se active la diferenciación celular, como paso previo a la adaptación del desarrollo de la planta. El trabajo que hemos llevado a cabo en el laboratorio nos ha permitido identificar a dos proteínas, MINIYO (IYO) y RIMA, que son componentes básicos de un interruptor molecular que inicia la diferenciación celular en Arabidopsis (Sanmartin et al., 2011; Muñoz et al., 2017). Nuestro modelo postula que IYO y RIMA forman un circuito binario que se activa cuando IYO se traslada desde el citosol al núcleo para activar la fase de elongación transcripcional de un conjunto de genes que desencadenan la diferenciación celular. Sin embargo, los elementos reguladores que controlan el funcionamiento de este interruptor siguen sin resolverse. Establecer los factores reguladores que delimitan la expresión de los componentes de este interruptor es una de las claves para desentrañar el mecanismo que permite la entrada en diferenciación así como para abordar su posterior activación “a la carta.” El proyecto que se propone tiene como objetivo la caracterización de varios motivos conservados en el promotor de IYO de distintas especies de brásicas y la determinación de su papel en la regulación de la expresión de IYO. Para ello, se plantea realizar ensayos de transactivación, cuantificando la actividad luciferasa, para demostrar si el FT asociado a estos motivos es capaz de activar al promotor de IYO. Estos estudios se complementarán con la generación y caracterización de versiones truncadas del promotor y/o mutagenizadas en las cajas predichas de unión al FT para confirmar su unión. En paralelo, se identificarán mutantes de pérdida de función del FT y se cruzarán con líneas marcadoras pIYO::GUS o pIYO::IYO-GFP disponibles en el laboratorio y se determinarán los cambios en su expresión. Finalmente, se caracterizarán líneas inducibles del FT para usarlas posteriormente en experimentos de inmunoprecipitación de cromatina para demostrar la unión del FT al promotor de IYO. Con este proyecto se pretende que el estudiante que lo realicé adquiera una sólida formación en biología molecular y celular, gracias a las distintas aproximaciones propuestas, y desarrolle un pensamiento científico crítico que le será de gran ayuda en su futuro profesional. Información de contacto: maite.sanmartin@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________ Investigador: Carmen Hernández Proyecto: Análisis de supresores virales del silenciamiento por RNA Los virus son parásitos intracelulares obligados que, dada su limitada capacidad codificante, necesitan utilizar numerosos recursos del hospedador para completar su ciclo infeccioso. El hospedador por su parte activa una serie de respuestas defensivas para frenar o limitar el avance de la infección viral. En plantas, una de las respuestas antivirales más eficientes está basada en el proceso de silenciamiento por RNA que es disparado por RNAs de doble cadena virales y que, en última instancia, conduce a la degradación del RNA del virus invasor. Los virus han desarrollado estrategias para contrarrestar este proceso entre las que destaca la producción de proteínas que actúan como supresores de la ruta de silenciamiento (VSRs), al interferir con distintas etapas de la misma. Estos VSRs están siendo objeto de intensa investigación, no sólo por su papel clave en el ciclo biológico de los virus, sino también porque están sirviendo como herramientas para desentrañar rutas de silenciamiento endógenas de la plantas (implicadas tanto en lucha antiviral como en regulación génica), porque constituyen dianas atractivas para el control de virosis y porque, además, presentan gran potencial biotecnológico. El objetivo del trabajo será seguir avanzando en el estudio del modo de acción de VSRs utilizando técnicas de Biología molecular y celular muy diversas, entre las que se incluyen PCR, clonación de DNA, purificación de DNA/RNA, electroforesis de ácidos nucleicos, análisis Northern y/o Western, microscopia confocal, manejo de virus, transformación de bacterias, agroinfiltración de plantas, etc. Información de contacto: cahernan@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________ INVESTIGADORES: Clara Pons y Antonio Granell Proyecto: Identificación de nuevos genes/ alelos que regulan caracteres de fruto como la maduración y vida post-cosecha en tomate. En el marco del proyecto TRADITOM financiado por la Unión Europea dentro del programa H2020 hemos caracterizado exhaustivamente una colección de más de 1700 variedades tradicionales de tomate europeo a nivel fenotípico con más de 500 caracteres cuantitativos y unos 30 caracteres cualitativos, como genotipando por secuenciación la colección completa. El análisis de información nos está permitiendo identificar regiones génicas y variantes alélicas asociadas a caracteres tan importantes como el tamaño y forma del fruto, la productividad, la producción de compuesto de sabor o saludables y el comportamiento post-cosecha. El candidato se incorporará al grupo ( http://pgb.ibmcp.csic.es/) para, utilizando estrategias de genomcia molecular y genética reversa llegar a definir los genes subyacentes a algunos de los efectos observados (forma, tamaño y composición a discutir con el candidato). Información de contacto: cpons@upvnet.upv.es; agranell@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________ Investigadores: Antonio Granell y José Luis Rambla Proyecto: Identificación de QTLs asociados al sabor y el aroma del tomate El sabor de los frutos es un tema que suscita creciente interés, habida cuenta de la queja generalizada entre los consumidores de la pobre calidad organoléptica de buena parte de los frutos disponibles en los centros de comercialización habituales. En este sentido, el tomate, lejos de ser una excepción, viene a ser uno de los blancos preferentes de estas quejas. El estudio del tomate tiene un gran interés, no solo por ser, junto con la patata, el producto hortícola más consumido a nivel mundial, sino también por utilizarse a nivel científico como modelo para el estudio del desarrollo y la maduración del fruto. En el caso del tomate, el sabor viene determinado por la integración en nuestro cerebro de las señales gustativas (limitada a unos pocos azúcares y ácidos) y la percepción olfativa por vía retronasal de más de 30 compuestos volátiles, los cuales le aportan todos los matices a los sabores básicos de dulce y ácido. En el trabajo que se propone, el objetivo es utilizar técnicas de Metabolómica y de GWAS con el fin de identificar regiones cromosómicas responsables de la biosíntesis de estos compuestos volátiles. Para ello se partirá de una colección que incluye variedades de tomate de tipo “cherry”, junto con Solanum lycopersicum var. cerasiforme y S. pimpinellifolium, la especie silvestre más próxima al tomate. Esta colección presenta cual presenta una variabilidad suficiente y una estructura genética adecuada para este tipo de análisis. Se realizarán el análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de los compuestos volátiles de los frutos de esta colección. Esto nos permitirá, junto con la información genotípica ya disponible de esta colección, utilizarlos para la identificación de las regiones cromosómicas responsables de su biosíntesis. Información de contacto: agranell@ibmcp.upv.es ; jrambla@ibmcp.upv.es ________________________________________________________________________________________ Investigadores: Antonio Monforte Proyecto: Mapeo fino de QTLs implicados en caracteres de calidad el fruto en melón En nuestro laboratorio hemos localizado en varios cromosomas del genoma de melón diversos QTLs implicados en caracteres de calidad de fruto como maduración y poscosecha, tamaño y forma del fruto. El objetivo a medio/largo plazo es identificar los genes responsables mediante una aproximación de mapeo posicional. Para ello es necesario primero realizar mapas de alta resolución que nos permitan aterrizar en las regiones donde se encuentran los genes y poder definir genes candidatos. El objetivo de este trabajo fin de máster es la obtención de un mapa de alta resolución para uno de los QTLs de calidad de fruto. Las tareas consistirán en análisis de secuencias para la definición de SNPs, generación de recombinantes, genotipado de SNPs, manejo del cultivo de melón en invernadero, cruzamientos, evaluación de frutos, análisis genéticos de segregación y ligamiento y búsqueda de genes candidatos. Información de contacto: amonforte@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________ Investigadores: Mari Cruz Castillo y José León Proyecto: Función de las proteínas con dominios VQ en las respuestas al óxido nítrico (NO) y a la transición hipoxia-normoxia. Las plantas y sus diferentes órganos experimentas cambios en los niveles de oxígeno a los que están expuestos debido a efectos ambientales pero también a procesos de desarrollo. En condiciones de bajos niveles de oxígeno (hipoxia) hay una sobreproducción de óxido nítrico (NO) debido a la utilización de nitrito en lugar de oxígeno como aceptor de electrones de la cadena mitocondrial. Cuando tras hipoxia la planta se re-oxigena y alcanza los niveles de oxígeno normales (normoxia) se desencadenan diversas respuestas muchas de las cuales están relacionadas con eventos oxidativos y con la función reguladora de factores de transcripción y de proteínas que modulan la función de estos factores, entre las que se encuentran algunas de las proteínas de la familia de proteínas con dominios VQ. Derivado del trabajo que venimos realizando en el proyecto en curso, hemos identificado que de los 34 genes de Arabidposis (Jing and Lin, Plant Physiol. 2015) que codifican proteínas con motivos VQ, hay 10 que se regulan en la transición hipoxia-normoxia y 12 que se regulan por NO, siendo 8 de ellos regulados por ambos factores. El Trabajo de Fin de Máster que planteamos está enfocado a la caracterización de la función de las 8 proteínas con motivo VQ que se regulan por los niveles de oxígeno y NO. Para ello, haremos uso de una estrategia de genética reversa basada en la caracterización de mutantes de inserción de T-DNA en los loci correspondientes. Generaremos combinaciones de dobles y triples mutantes en los casos en los que se considere necesario para evitar los efectos de la redundancia funcional. Los mutantes simples y múltiples se caracterizarán en términos de producción endógena y sensibilidad a NO y en tolerancia y respuesta a variaciones en los niveles de oxígeno. Los experimentos de hipoxia y reoxigenación se llevarán a cabo en un dispositivo en el que podemos controlar los niveles de oxígeno a los que estarán expuestas las plantas y para los que tenemos también optimizados una serie de genes marcadores tanto para la fase de hipoxia como para la posterior re-oxigenación. Información de contacto: jleon@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________ Investigador: José León Proyecto: Interacción funcional entre el óxido nítrico (NO) y el metabolismo y señalización de giberelinas y estrigolactonas. El óxido nítrico (NO) regula tanto el desarrollo como las respuestas estrés de las plantas a través de la regulación de la expresión génica, el control de la función, modificaciones postraduccionales (PTMs) y estabilidad de las proteínas, y finalmente, modulando el metabolismo y la acción de moléculas reguladoras. En nuestro grupo de investigación, identificamos hace unos años que el NO regula la acción de algunas hormonas como el ABA a través de PTMs basadas en la nitración de tirosinas clave en los receptores de la familia PYR/PYL (Castillo et al, Science Signaling 2015); y más recientemente, hemos identificado que plantas deficientes en la producción o señalización de estrigolactonas son insensibles a NO (Castillo et al. JXB 2018), debido, al menos en parte, a efectos sobre el metabolismo de giberelinas catalizado por GA2ox2, el producto del gen AtGA2ox2 inducible por NO y estrigolactonas. El Trabajo de Fin de Máster que planteamos está enfocado a la caracterización genética de la interacción entre estrigolactonas y giberelinas que regula la sensibilidad de la planta a NO y, a la inversa, en analizar como el NO modula la función reguladora de dichas hormonas presumiblemente a través de PTMs. Se analizarán modificaciones como la nitración, S-nitrosilación y poliubiquitilación de la GA2ox2 de Arabidopsis mediante un protocolo basado en el uso de líneas transgénicas que expresan un versión etiquetada de GA2ox2 con hemaglutinina (HA), lo que facilita su purificación y posterior análisis. Los resultados obtenidos in vivo se combinarán con otros análisis in vitro utilizando proteína GA2ox2 recombinante etiquetada con poliHistidinas y expresada en E. coli, la cual utilizaremos para analizar los efectos de PTMs y de mutagénesis dirigida de residuos modificados sobre su actividad. Nuestro objetivo final será dilucidar el mecanismo de regulación recíproco entre el NO y las hormonas (giberelinas y estrigolactonas) en diferentes situaciones a lo largo del desarrollo o en diversas condiciones de estrés. Información de contacto: jleon@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________ Investigadores: José Mª Bellés, Purificación Lisón, Mª Pilar López-Gresa, Ismael Rodrigo. Proyecto: Estudio de genes y metabolitos implicados en la resistencia de las plantas de tomate frente a patógenos. A lo largo de la evolución, las plantas han ido desarrollando sistemas de defensa frente a diversas agresiones abióticas y bióticas por parte de su entorno. Estos sistemas defensivos incluyen tanto barreras constitutivas como defensas inducibles. En respuesta a las señales de estrés, las plantas sintetizan proteínas de defensa y compuestos químicos de diversa naturaleza. Estos compuestos pueden ejercer funciones defensivas directas, esto es, actuando como antioxidantes, antibacterianos o antifúngicos, o actuar como metabolitos defensivos indirectos, señalizando la respuesta defensiva. Algunos compuestos volátiles (VOCs) y otros, tales como los alcaloides y compuestos fenólicos de mayor polaridad y peso molecular, pertenecen a este grupo de compuestos defensivos. Empleando diferentes interacciones planta-patógeno tales como tomate-Pseudomonas syringae, tomate-Fusarium oxysporum, tomate-Virus del mosaico del tomate y tomate-Viroide de la Exocortis de los Cítricos, en nuestro laboratorio estamos interesados en caracterizar componentes proteicos y metabólicos que constituyen dicha respuesta de defensa en tomate. Nuestro objetivo general es contribuir al conocimiento del sistema defensivo de las plantas y obtener plantas más resistentes a las agresiones externas, así como encontrar compuestos naturales asociados a la respuesta defensiva con interés biotecnológico. Información de contacto: mplopez@ceqa.upv.es; plison@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________ Investigador: Miguel A. Blázquez Proyecto: Evolución de la co-regulación transcripcional por luz y temperatura en plantas Una característica muy llamativa de las plantas es su capacidad para monitorizar el entorno y cambiar su comportamiento para adaptarse y optimizar el uso de recursos. Entre las señales principales que emplean las plantas para conocer el ambiente están la intensidad y calidad de la luz (su color), así como la temperatura ambiental. Ambas señales están relacionadas en el origen, ya que la luz suele influir en la temperatura. De hecho, los resultados más recientes obtenidos con Arabidopsis thaliana indican que ambas señales se perciben y se transducen a través de un mismo circuito genético. Es decir, algunos fotorreceptores son también termosensores, y otras proteínas señalizadoras reaccionan tanto a cambios en luz como en temperatura. Sin embargo, hay varias preguntas que surgen sobre el origen de este circuito común: ¿este circuito existía ya en las primeras plantas que colonizaron la tierra, o se ha ido ensamblando durante la evolución en la superficie terrestre? En caso de estar presente en las primeras plantas terrestres, ¿fue una innovación de estas plantas, o ya venía programado de sus ancestros acuáticos? El Trabajo de Fin de Máster que planteamos pretende abordar esta cuestión mediante el análisis genómico de la respuesta a señales combinadas de luz y temperatura en plantas que divergieron en distintos momentos de la evolución. En concreto, se analizarán transcriptomas de un alga microscópica de ambiente marino (Chlamydomonas reinhardtii), una de agua dulce (Klebsormidium nitens), una planta terrestre de divergencia muy temprana (Marchantia polymorpha), y una planta vascular (Arabidopsis thaliana) cultivadas en alta luz y alta temperatura, alta luz y baja temperatura, baja luz y alta temperatura, etc. El grado de coincidencia entre los genes co-regulados por luz y temperatura entre las distintas especies nos permitirá hipotetizar el momento en el que surgió la señalización común entre ambas señales. Desde un punto de vista biotecnológico, estos resultados pueden darnos indicaciones sobre el tipo de modificaciones que es razonable perseguir en plantas cultivadas para mejorar su adaptabilidad en un contexto futuro de cambio climático, en cierto modo equivalente al que sufrieron las primeras plantas terrestres. Información de contacto: mblazquez@ibmcp.upv.es http://plasticity.ibmcp.csic.es/ _______________________________________________________________________ INVESTIGADOR: Alberto Carbonell Proyecto: Identificación de las proteínas que interaccionan con los complejos ARGONAUTA de plantas en respuesta a estrés Los cultivos agrícolas se ven afectados por múltiples estreses medioambientales como son la falta de agua, el exceso de salinidad de algunos suelos, o la infección por diversos agentes patógenos. Para hacer frente a dichos estreses, las plantas ponen en marcha una serie de mecanismos moleculares que regulan la expresión de sus genes. El silenciamiento génico mediado por RNA es uno de los mecanismos de regulación de la expresión génica más importantes en plantas ya que controla no sólo la respuesta a distintos estreses abióticos y bióticos sino que también es crucial en la regulación del desarrollo de la planta y en el control de la estabilidad de su genoma. Las proteínas de la familia ARGONAUTA (AGO) son el componente central de los complejos efectores de silenciamiento génico, que además incluyen un pequeño RNA (sRNA) y un RNA diana. En las rutas de silenciamiento génico post-transcripcional, una proteína AGO se asocia primero con un sRNA, y posteriormente el complejo AGO-sRNA se une a aquellos RNAs celulares con elevada complementariedad de secuencia con el sRNA. Como resultado, los RNAs diana son degradados, lo que conduce a la inactivación o “silenciamiento” de los genes correspondientes. En nuestro grupo hemos contribuido a la identificación a nivel genómico de los RNAs (tanto sRNAs como RNAs diana) que interaccionan con distintas proteínas AGO, y ahora estamos interesados en identificar el conjunto de proteínas interactoras que puedan forman parte también de distintos complejos AGO. El objetivo concreto del presente Trabajo de Fin de Máster (TFM) es la identificación de las proteínas que interaccionan con los complejos AGO1 y AGO2 en respuesta a estrés abiótico o biótico, como es el estrés salino o la infección por virus, respectivamente. Para alcanzar este objetivo, se generarán y someterán a estrés plantas transformadas de Arabidopsis thaliana que expresen versiones de AGO1 o AGO2 etiquetadas con la etiqueta de afinidad de última generación Twin-Strep-tag (TST). Dicha etiqueta permitirá purificar los complejos TST-AGO1 y TST-AGO2 en condiciones fisiológicas, mediante un sistema de cromatografía líquida del que disponemos en el laboratorio. Los complejos purificados se analizarán por espectrometría de masas en tándem de alto rendimiento, y finalmente se obtendrá una lista de aquellas proteínas (posibles interactores) cuyos péptidos resulten enriquecidos en las fracciones TST-AGO en comparación con las muestras control. Los posibles interactores se validarán con ensayos de tipo bioquímico, molecular y/o genético. En definitiva, el conocimiento generado en este TFM deberá facilitar el desarrollo de plantas mejor adaptadas a los cambios medioambientales o más resistentes a patógenos. Nota: -Este TFM se realizará en el marco del proyecto RTI2018-095118-A-100 que oferta un contrato predoctoral FPI. Información de contacto: acarbonell@ibmcp.upv.es _______________________________________________________________________ Investigadores: Ludovico Dreni, Cristina Ferrándiz. Proyecto: Identificación de los factores de transcripción que controlan la reproducción y la fertilidad en el arroz (Oryza sativa L.). El arroz, es la principal fuente alimentaria en todo el mundo junto con el trigo y el maíz. Además, de ser muy importante para la agricultura, es la base fundamental de la cocina local Valenciana. El arroz es una de las plantas modelo más importantes para estudios moleculares, ya que en las últimas décadas se han estandarizado metodologías y protocolos eficientes que nos permiten crecer y manipular esta especie. La reproducción de las plantas está controlada por una red compleja de diferentes familias de factores de transcripción entre las cuales se encuentran: MADS-box, Homeobox, APETALA2, bHLH, B3 y YABBY. Nuestro trabajo se centra en conocer e identificar cuales factores están implicados en el desarrollo genético y evolutivo del arroz. En particular, pretendemos comprender la evolución y la regulación básica de las plantas de arroz. Asiendo énfasis, en su desarrollo, arquitectura de la inflorescencia y la producción de fruto, lo que nos permitirá mejorar la producción de los cultivos. Con este objetivo también tenemos en cuenta, el número de semillas, el control de la identidad de los tejidos y órganos florales: glumas, estambres, pistilo, etc. Además, ponemos especial atención en los tejidos que componen el pistilo: pared del ovario, estilo, tracto de transmisión y estigma. Con este propósito, hemos desarrollado una sólida red internacional de colaboraciones que incluye laboratorios en China, Australia, Europa, México y América del Sur, con investigadores internacionales que visitan con frecuencia nuestro laboratorio. Nuestro trabajo en el laboratorio está dirigido al desarrollo reproductivo del arroz de tipo silvestre y líneas mutantes. Con las cuales trabajaremos en la propagación y crecimiento de arroz en fitotrones, pruebas de PCR para identificar y detectar mutantes T-ADN y CRISPR-Cas9, técnicas clonación (ligación, Gateway, Infusion, GoldenBraid…), histología, microscopía óptica, electrónica y confocal, análisis de expresión mediante qRT-PCR, hibridación de ARN in situ, ARNseq, transformación de plantas, interacción de proteínas, estudios comparativos Evo-Devo (Evolution - Development) entre arroz, cebada, Arabidopsis y algunas legumbres, etc. Claramente, con nosotros tienes muchas oportunidades para desarrollar un proyecto de tesis de master enfocado en un área con una amplia proyección en la investigación biotecnológica. Información de contacto: ludovico.dreni@gmail.com, cferrandiz@ibmcp.upv.es. ________________________________________________________________________________________
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Fecha: 
Tuesday, 5 November, 2019